Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге - Коллектив авторов Страница 19

Клинико-диагностическое значение

Результаты определения общего белка сыворотки крови могут быть ложно завышены при наличии липидемии, желтухи, гемолиза. Продолжительное наложение жгута повышает концентрацию всех белков в пробе.

Пробы, полученные выше места внутривенной инфузии, могут дать ошибочно заниженные результаты из-за локальной гемодилюции.

Увеличение содержания белка более 90 г/л имеет место при гипериммуноглобулинемии, поликлональных или моноклональных гаммопатиях.

Снижение содержания белка ниже 60 г/л в сочетании с потерей белка наблюдается при белоктеряющих гастроэнтеропатиях, острых ожогах, нефротическом синдроме.

Понижение содержания белка, вызванное снижением синтеза белка, наблюдается при белковой недостаточности (тяжелая форма), хронических болезнях печени, синдроме мальабсорбции, нарушениях питания, α-γ-глобулинемии.

Спектрофотометрические методы определения общего белка

Данная группа методов основана на измерении светопоглощения в ультрафиолетовой области. Характерные длины волн для поглощения растворов белка – 200–225 нм (обуславливается пептидными связями) и 270–290 нм (обусловлено присутствием ароматических аминокислот, таких как тирозин, триптофан, фенилаланин в молекуле белка).

Данный метод характеризуется высокой погрешностью и недостаточно высокой эффективностью, поскольку содержание ароматических аминокислот отличается в различных белках сыворотке крови.

Определение белковых фракций сыворотки крови методом электрофореза

При изучении белкового спектра крови в качестве унифицированного метода используется зональный электрофорез с поддерживающей средой-носителем.

Принцип метода

Под влиянием постоянного электрического поля белки сыворотки, имеющие отрицательный заряд, движутся по смоченной буферным раствором бумаге по направлению к положительному электроду со скоростью, зависящей от величины заряда и молекулярной массы частиц. Вследствие этого белки сыворотки крови разделяются на 5 фракций: альбумины, α1-, α2-, β-, γ-глобулины.

Альбумины обладают выраженным отрицательным зарядом и небольшой молекулярной массой, поэтому они продвигаются в электрическом поле с наибольшей скоростью и дальше других фракций отстают от линии старта. С меньшей скоростью движутся α1-, α2– и β-глобулины.

Наименьшей скоростью продвижения отличаются γ-глобулины, они практически остаются на линии старта. γ-глобулины – крупные белковые молекулы, их заряд близок к нейтральному.

Окрашенные пятна белковых фракций, полученные методом электрофореза на бумаге или других носителях, носят название электрофореграммы.

Измерения и Расчет содержания белковых фракций проводят при денситометрическом сканировании электрофореграмм. Получаемые денситограммы представляют собой графики зависимости оптической плотности и подвижности каждой фракции. Площадь пика пропорциональна количеству белков, находящихся в соответствующей фракции.

Каждая фракция имеет определенный состав белков. Процентное содержание отдельных белковых фракций меняется при многих заболеваниях, хотя общее содержание белка в сыворотке крови может оставаться в пределах нормы (диспротеинемия).

С помощью электрофореза можно провести первый этап оценки следующих патофизиологических процессов: иммунодефицит, активация гуморального звена иммунитета, воспалительный процесс, активация комплемента, снижение синтеза белка, состояние потери белка, внутрисосудистый гемолиз, генетические варианты белков, моно– и поликлональные γ-патии (парапротеинемии).

У здоровых людей содержание альбумина составляет 56,3–68,8%, α1-глобулинов – 3–5,8%, α2-глобулинов – 6,9–10,5%, β-глобулинов – 7,3–12,5%, γ-глобулинов – 12,7–19,2%.

Унифицированный метод электрофоретического разделения на пленках из ацетата целлюлозы

Необходимые реактивы

1. 5,5-диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль (мединал), фарм.

2. Лимонная кислота.

3. Барбитал-цитратный (мединал-цитратный) буфер рН 8,6: 7,36 г 5,5-диэтилбарбитурата натрия (мединала), 0,3 г лимонной кислоты растворяют в 700 мл воды в мерной колбе вместимостью 1 л, проверяют рН и доводят водой до метки.

4. Бромфеноловый синий водорастворимый, индикатор.

5. Ртуть двухлористая (сулема, хлорная ртуть).

6. Уксусная кислота ледяная.

7. Пунцовый С.

8. Кислотный красный 2Ж.

9. Трихлоруксусная кислота, раствор 50 г/л.

10. Растворы для окрашивания:

– раствор бромфенолового синего, 0,5 г/л: 10 г двухлористой ртути и 20 мл ледяной уксусной кислоты растворяют в небольшом количестве воды при нагревании на водяной бане, непрерывно помешивая до полного растворения сулемы. Отдельно растворяют 0,5 г бромфенолового синего в воде. Оба раствора помещают в мерную колбу вместимостью 1 л и доводят водой до метки;

– раствор пунцового С: 0,3 г краски растворяют в 100 мл 50 г/л раствора трихлоруксусной кислоты;

– раствор кислого красного 2Ж: 0,3 г краски растворяют в 100 мл 50 г/л раствора трихлоруксусной кислоты.

11. Отмывающий раствор – уксусная кислота, 50 г/л раствор.

12. Просветляющие растворы:

– вазелиновое масло;

– смесь: ледяная уксусная кислота и ацетон (1 : 1).

Специальное оборудование

1. Прибор для электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы.

2. Пленка из ацетата целлюлозы.

3. Денситометр.

Ход определения

Подготовка прибора: прежде чем приступить к работе, необходимо ознакомиться с инструкцией по эксплуатации прибора. В соответствии с инструкцией заполняют камеры прибора буферным раствором. Следят, чтобы уровень буфера был одинаковым в обеих камерах.

Подготовка пленок из ацетата целлюлозы: смачивают пленки буферным раствором (помещают в буферный раствор на 5 мин). Удаляют избыток влаги фильтровальной бумагой. Закрепляют пленку матовой стороной кверху (пленки должны располагаться параллельно друг другу и строго параллельно стенкам прибора, не должны провисать). Закрывают камеру крышкой и пропускают ток напряжением 150 В в течение 5 мин, после чего выключают ток.

Нанесение сыворотки: на катодный край пленки наносят 1–4 мкл сыворотки в виде узкой полоски, так чтобы полоски не доходили до края пленки.

Проведение электрофореза: включают ток и проводят электрофоретическое разделение в течение 20 мин при напряжении 150 В и силе тока 1 мА на 1 см поперечного сечения полоски.

Обработка пленок из ацетата целлюлозы: выключают ток, вынимают пленки, высушивают их вначале на воздухе в течение 5–10 мин, затем (для фиксации) в сушильном шкафу при 100 °С в течение 10 мин. Окрашивают в течение 15 мин одним из указанных красителей, после чего пленки несколько раз отмывают от избытка красителя 50 г/л раствором уксусной кислоты до исчезновения фона (3–4 раза). После отмывки пленки промокают фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе. Затем пленки просветляют в одном из просветляющих растворов.

Расчет

Измерение проводят на денситометре. Результаты выражают в процентах.

Примечания

1. Можно использовать барбиталовый (мединал-вероналовый) буфер такого же состава, как и для электрофореза на бумаге.

2. После проведения электрофореза буфер из катодной и анодной камер смешивают, что дает возможность использовать его несколько раз.

Электрофоретическое разделение на бумаге

Необходимые реактивы

1. Буфер. Можно использовать различные виды буферов – мединал-вероналовый, боратный, трис-буфер:

– мединал-вероналовый буфер рН 8,6: 10,3 г мединала и 1,84 г веронала растворяют и доводят до 1 л водой;

– трис-буфер рН 8,9: трис-(оксиметил)-аминометан – 60,5 г, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) – 6 г, борная кислота – 4,6 г, вода – до 1 л.

2. Раствор красителя. Используют различные красители – бромфеноловый синий, амидо черный, азокармин Б и