Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге - Коллектив авторов Страница 21

Ход определения

К 6 мл тимолово-вероналового буферного раствора прибавляют 0,1 мл сыворотки, оставляют стоять 30 мин и затем измеряют оптическую плотность при длине волны 630–690 нм (красный светофильтр) против тимолово-вероналового буфера в кюветах с толщиной слоя в 1 см. Реакцию проводят при комнатной температуре.

Расчет ведут по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из калибровочного раствора сульфата бария (суспензии) готовят разведения, соответствующие единицам помутнения по Шенк—Хогланд. Калибровочные растворы хорошо встряхивают и тотчас при длине волны 630–690 нм в кюветах с толщиной слоя в 1 см против воды измеряют.

Таблица 8

Тимоловая проба

Примечание

Можно использовать готовый набор реактивов Био-Ла-Тест «Тимоловая проба» («Лахема»), в состав которого входят трис-буфер и малеиновая кислота.

Подобно всем флокуляционным тестам, тимоловая проба является неспецифической реакцией.

Однако она достаточно информативна для оценки функционального состояния печени. Проба положительна в 90–100% случаев при вирусном гепатите уже в преджелтушной стадии, при безжелтушной форме заболевания, а также при токсическом гепатите, постнекротическом циррозе печени, коллагенозах, малярии, вирусных инфекциях. При механической желтухе проба отрицательна.

Норма – 0,4 единицы.

Определение компонентов остаточного азота

Азотистый обмен включает реакции синтеза и распада белков, нуклеиновых кислот, аминокислот, нуклеотидов, а также ряда других азотсодержащих соединений. Для оценки состояния азотистого обмена определяют фракции остаточного азота в сыворотке или в цельной крови. Остаточный азот – это небелковый азот или азот, который остается в центрифугате (фильтрате) сыворотки крови или другой биожидкости после осаждения белков трихлоруксусной, фосфорно-молибденовой или фосфорно-вольфрамовой кислотой. Содержание остаточного азота и его компонентов в сыворотке крови в норме:

1) остаточный азот – 14,3–28,6 ммоль/л;

2) мочевина – 2,50–8,33 ммоль/л;

3) аминоазот (азот аминокислот)– 0,02–0,05 г/л;

4) мочевая кислота М – 0,24–0,50 ммоль/л, Ж – 0,16–0,44 ммоль/л;

5) креатин – 102–408 мкмоль/л;

6) креатинин М – 71–115 мкмоль/л, Ж – 53–97 мкмоль/л;

7) индикан – 0,87–3,13 мкмоль/л;

8) аммиак (цельная кровь) – 17–34 мкмоль/л;

9) ксантопротеиновая реакция – 20 условных единиц.

Увеличение концентрации остаточного азота выше 0,4–0,5 г/л обозначается термином «азотемия». Абсолютная азотемия связана либо с задержкой азотистых шлаков при нарушении функции почек (почечная или ретенционная азотемия) либо с их усиленным образованием (внепочечная или продукционная азотемия). Относительная азотемия наблюдается при дегидратации организма.

Считается, что резкое повышение фракций остаточного азота является плохим прогностическим признаком. Однако следует иметь в виду, что при острых заболеваниях азотемия может носить временный характер.

Основным компонентом фракций остаточного азота является азот мочевины, на долю которого приходится более половины всего остаточного азота.

Методы исследования мочевины сыворотки крови

Из всего разнообразия методов исследования мочевины в качестве унифицированных в лабораториях утверждены следующие:

1) экспресс-метод определения содержания мочевины с использованием реактивной бумаги «Уратест»;

2) диацетилмонооксимный метод, который может быть применен при работе как с отечественными реактивами, так и с наборами реактивов фирмы «Лахема»;

3) ферментативный метод с применением кристаллического препарата уреазы.

Диацетилмонооксимный метод определения мочевины

Принцип метода

Мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа красный комплекс.

Необходимые реактивы

1. Трихлоруксусная кислота, 100 г/л.

2. Диацетилмонооксим, 25 г/л водный раствор. Реактив стабилен.

3. Тиосемикарбазид, 2,5 г/л водный раствор. Для приготовления реактива можно пользоваться также тиосемикарбазида гидрохлоридом; последний применяется в виде 3,2 г/л водного раствора.

Оба реактива стабильны при хранении в темной посуде при комнатной температуре.

4. Серная кислота концентрированная.

5. Ортофосфорная кислота 85%-ная.

6. Хлорное железо. Основной раствор хлорного железа: 5 г хлорного железа доводят до 100 мл водой и подкисляют добавлением 1 мл концентрированной серной кислоты. Из основного раствора готовят рабочий раствор хлорного железа: 1 мл основного раствора хлорного железа доводят до 100 мл водой, затем добавляют 8 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл 85%-ной ортофосфорной кислоты. Хранят в темной посуде. Годен в течение 2 недель.

7. Бензойная кислота, 2 г/л. 0,2 г кристаллической бензойной кислоты растворяют в 100 мл воды при интенсивном перемешивании на водяной бане.

8. Мочевина для приготовления калибровочного раствора. Готовят 7 ммоль/л раствор мочевины: 42 мг мочевины растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл. В качестве растворителя можно использовать 2 г/л раствор бензойной кислоты. Калибровочный раствор, приготовленный на растворе бензойной кислоты, стабильнее, чем водный; 1 мл калибровочного раствора содержит 0,007 ммоль мочевины.

9. Цветной реактив: к 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавляют 20 мл воды, 1 мл 25 г/л раствора диацетилмонооксима и 0,25 мл 2,5 г/л раствора тиосемикарбазида. Цветной реактив готовят каждый раз перед употреблением.

Ход определения мочевины в сыворотке крови

Опытная проба: в центрифужную пробирку наливают 0,8 мл воды, 0,2 мл сыворотки и 1 мл 100 г/л раствора трихлоруксусной кислоты, смешивают. Через 15–20 мин центрифугируют. В чистую пробирку вносят 0,5 мл надосадочной жидкости и 5 мл цветного реактива. Пробирку выдерживают на кипящей водяной бане в течение 20 мин, затем охлаждают в течение 2–3 мин под проточной водой. Измерение проводят на фотометре при длине волны 530–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы в кювете с толщиной слоя в 1 см. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо надосадочной жидкости берут 0,5 мл воды.

Расчет проводят по формуле путем сравнения с калибровочной пробой. Калибровочную пробу ставят аналогично опытной, но вместо сыворотки берут 0,2 мл калибровочного раствора.

Концентрация мочевины, ммоль/л:

Еоп/ Ек× Ск,

где Еоп – экстинкция опытной пробы;

Ек – экстинкция калибровочной пробы;

Ск – концентрация мочевины в калибровочном растворе, 7 ммоль/л.

Определение мочевины в моче проводят аналогично определению мочевины в сыворотке крови, но вместо сыворотки берут 0,2 мл разведенной мочи. Параллельно обрабатывают калибровочную пробу, как описано для определения мочевины в сыворотке крови.

Расчет мочевины на суточное количество мочи производят по следующей формуле:

Мсут= Ск× Еоп× а × К / Ек× б,

где Мсут – количество мочевины в суточной моче, ммоль;

Еоп – экстинкция опытной пробы;

Ек – экстинкция калибровочной пробы;

Ск – содержание мочевины в калибровочном растворе, ммоль;

а – суточное количество мочи, мл;

б – количество мочи, взятое на