Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге - Коллектив авторов Страница 31

с 1954 г., когда было выяснено диагностическое значение нарастания активности ACT и АЛТ. Последующие годы подтвердили, что ряд заболеваний (в первую очередь инфаркт миокарда) вызывает преходящий подъем активности ряда ферментов плазмы и сыворотки крови. Каждый фермент в процессе заболевания отличает время первоначального появления в сыворотке и плазме, достижение максимальной активности, инактивация.

По мере развития патологического процесса в органе происходят прогрессирующее нарушение целостности клеточных стенок и утечка ферментов.

В плазме или сыворотке накапливается добавочное количество ферментов, набор которых характеризует их состав в пораженном органе. Абсолютное повышение активности определенного фермента связано со степенью повреждения ткани, его активность зависит от молекулярной массы и количества фермента в органе. Длительность периода полураспада ферментов является главным фактором, определяющим период времени, когда активность фермента повышена в плазме или сыворотке крови.

Определение активности аминотрансфераз (АЛТ, АСТ)

АЛТ (АлАТ) присутствует в очень больших количествах в печени и почках, в меньших – в скелетных мышцах и сердце. ACT (АсАТ) распределена во всех тканях тела. Наибольшая активность имеется в печени, сердце, скелетных мышцах и эритроцитах.

Принцип метода

Аспартат-аминотрансфераза катализирует реакцию между L-аспартатом и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и оксалацетат. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов 2– оксоглутаровой и пировиноградной кислот в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты, возникающий при самопроизвольном декарбоксилировании оксалацетата, обладает более высокой оптической плотностью.

Аланин-аминотрансфераза катализирует реакцию между L– аланином и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и соль пировиноградной кислоты. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислот в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты обладает более высокой оптической плотностью.

Повышенное содержание кетоновых тел (в сыворотках больных диабетом) вызывает завышение активности ферментов ACT и АЛТ.

Гемолиз повышает активность ACT или АЛТ в сыворотке крови. Снижение результатов вызывают синтетические моющие средства.

Пределы активности:

АЛТ 5 – 30 Ед/л × 0,017 или 0,09–0,51 мккат/л;

ACT 7–18 Ед/л × 0,017 или 0,12–0,31 мккат/л.

Метод определения активности АСТ

Необходимые реактивы

1. Калия фосфат однозамещенный (КН2РО4).

2. Калия фосфат двузамещенный (К2НРО4 × 3Н2О).

3. L-аспарагиновая кислота или L-аспарагиновой кислоты натриевая соль.

4. Фосфатный буфер 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г однозамещенного фосфата калия и 2,07 г двузамещенного фосфата калия трехводного растворяют в 40–160 мл воды, проверяют рН и доводят водой в мерной колбе до 100 мл. Стабилен при хранении в холодильнике.

5. Субстратно-буферный раствор 0,25 моль/л L-аспарагиновой кислоты в 0,1 моль/л фосфатном буфере рН 7,4: 3,30 г L– аспарагиновой кислоты (или 3,9 г натриевой соли L-аспарагиновой кислоты) растворяют в 40–50 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера, проверяют рН и доводят фосфатным буфером в мерной колбе до 100 мл. Если применяют L-acпaрагиновую кислоту, то к навеске перед растворением в фосфатном буфере для установления рН 7,4 добавляют примерно 20–26 мл 1 моль/л раствора едкого натра и затем проверяют рН. Стабилен при хранении в холодильнике в течение месяца.

6. β-никотинамидадениндинуклеотид восстановленный, динатриевая соль, 15 ммоль/л: 16 мг НАДH × Na2 × 4H2O растворяют в 1,5 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в темной посуде в холодильнике. Коэффициент молярного поглощения не ниже 5,6 × 102 м2 × моль–1 при 340 нм.

7. α-кетоглутаровая кислота, 0,45 моль/л: 0,2 г α-кетоглутаровой кислоты растворяют в 2,5 мл воды и добавляют 5 моль/ л раствора едкого натра. Если используют динатриевую соль α– кетоглутаровой кислоты, то 0,26 г соли растворяют в 3 мл воды, раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в холодильнике. α-кетоглутаровая кислота не должна содержать примесей пирувата и малата.

8. Малатдегидрогеназа из сердца свиньи (L-малат: NAD + оксидоредуктаза). Суспензия в 50%-ном растворе глицерина. Специфическая каталитическая активность выше 17 ммоль/(с × л). Примеси: АсАТ < 0,01%, ГлДГ < 0,003%, ЛДГ < 0,01%. Для приготовления рабочего раствора к 20 мкл суспензии добавляют 5 мл воды.

9. Лактатдегидрогеназа из скелетной мышцы кролика или свиньи. Суспензия в 50%-ном растворе глицерина. Специфическая каталитическая активность выше 8 ммоль/(с × л). Примеси: АсАТ < 0,01%, ГлДГ < 0,003%, АлАТ < 0,01%. Для приготовления рабочего раствора к 40 мкл суспензии добавляют 5 мл воды. Стабилен в течение 3 месяцев при хранении в холодильнике в хорошо укупоренной посуде.

10. Натр едкий, 5 моль/л; 1 моль/л.

11. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (физиологический раствор).

Примечание

Для определения активности АсАТ и АлАТ по оптическому тесту используют отечественные реактивы или импортные, например реактивы фирмы «Reanal». Все реактивы готовят на бидистиллированной воде, хранят при температуре от 0 до +4 °С. Уменьшение стабильности может наступить за счет роста микроорганизмов.

Поэтому в растворы рекомендуется добавлять несколько капель хлороформа.

Специальное оборудование

Спектрофотометр с термостатированной кюветой. Измерение проводят при 340 нм.

Ход определения

Перед определением температура растворов и сыворотки должна быть доведена до температуры измерения. Перед работой можно готовить смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, раствора НАДН, МДГ и ЛДГ в соотношении 60 : 1 : 1 : 1. Определение проводят по следующей схеме (табл. 15).

Таблица 15

Определение активности АСТ

Перемешивают и через 60 с (лаг-фаза) измеряют экстинкцию и одновременно включают секундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или через более короткие, но равные промежутки времени) измеряют экстинкцию.

Поправку на холостой опыт проводят по формуле:

(ΔЕ / Δt)оп– (ΔЕ / Δt)хол= (ΔЕ / Δt)скор.

Скорректированную величину опытной пробы используют в дальнейших Расчетах. Расчет производят по формуле:

Активность, моль / (с × м3) = нмоль / (с × л) × 106= Vр.с/ ε × l × Vсыв× (ΔЕ / Δt)скор,

где Vр.с – объем реакционной смеси, мл;

Vсыв – объем сыворотки, мл;

t – время реакции, с;

ΔЕ / Δt – изменение экстинкции за 1 с;

ε – коэффициент молярной экстинкции НАДН в м2 × моль–1;

l – толщина слоя жидкости в кювете в сантиметрах.

Примечание

Определение активности фермента можно проводить по микрометоду. Для этого перед работой готовят смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, растворов НАДН, ЛДГ, МДГ в соотношении 60 : 1 : 1 : 1. Опытная проба включает смесь реактивов – 0,630 мл, сыворотку – 0,10 мл, α– кетоглутаровую кислоту – 0,02 мл. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо сыворотки добавляют 154 ммоль/л раствор хлорида натрия.