Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге - Коллектив авторов Страница 47

3. Гидразина сульфат, насыщенный раствор, готовят, заливая 2,5 г препарата 100 мл воды.

4. Раствор сульфонированного батофенантролина: в пробирке к 100 мг батофенантролина (4,7-дифенил-1,10-фенантролина) приливают 0,5 мл хлорсульфоновой кислоты, нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 с, охлаждают и медленно приливают 10 мл воды, после чего снова нагревают на водяной бане в течение 5 мин и разбавляют 100 мл воды, добавляя 5 н NaOH, устанавливают рН 4,0 и доводят объем водой до 200 мл.

5. Калибровочный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/л. Сначала готовят раствор соли Мора (железо-аммиачные квасцы, аммоний-железо II сернокислое), FeSO4 × (NH4)SO4 × 6H2O, содержащий 3 ммоль/л, растворяя 1,178 г в 5 мл 0,3 н НСl и доводя объем до 1 л водой, содержащей в 1 л 1 мл концентрированной серной кислоты. Этот раствор разводят подкисленной водой в 100 раз; получается раствор, содержащий 30 мкмоль/л, или 1,67 мкг/мл.

Ход исследования

К 2 мл исследуемой сыворотки прибавляют 2,5 мл воды и 1,5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и ставят на 15 мин на водяную баню температурой 90–95 °С. Затем центрифугируют в течение 20 мин при скорости 2000 об./мин и отбирают 4 мл прозрачного слоя, к которым приливают 0,35 мл 70%-ного раствора аммония ацетата и 0,3 мл раствора сульфата гидразина. Смесь фотометрируют при длине волны 535 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см, затем прибавляют 0,4 мл раствора сульфонированного батофенантролина, оставляют на 1 ч и снова фотометрируют при той же длине волны. Обе фотометрии выполняют против холостого опыта, в котором берут вместо исследуемой сыворотки 2 мл воды.

Калибровку проводят так же, как и основной опыт, но вместо сыворотки берут 2 мл калибровочного раствора.

Расчет сывороточного железа (мкмоль/л) выполняют по формуле:

Еоп1– Еоп2/ Ек1– Ек2× 30,

где Еоп1 и Еоп2 – отсчеты опытной пробы до и после прибавления раствора сульфонированного батофенантролина;

Ек1 и Ек2 – соответственно результаты фотометрии калибровочной пробы;

30 – содержание железа в калибровочном растворе, мкмоль/л.

Надо тщательно следить за содержанием железа в дистиллированной воде и реактивах, используя в случае необходимости бидистиллированную воду, приготовленную в стеклянном перегонном аппарате. Если после удаления белков не удается набрать точно 4 мл надосадочной жидкости, можно взять меньшее ее количество и сделать поправку при Расчете или же взять точно такое же количество калибровочного раствора.

Определение железа по цветной реакции со спиртовым раствором батофенантролина

Принцип метода

Сывороточное железо восстанавливают тиогликолевой кислотой, белки осаждают трихлоруксусной кислотой, в фильтрате устанавливают нужную величину рН, добавляя ацетат натрия, и проводят цветную реакцию с батофенантролином. В связи с тем что он в воде не растворяется, используют спиртовой раствор.

Необходимые реактивы

1. Кислота тиогликолевая, кислота трихлоруксусная, раствор 400 г/л.

2. Натрия ацетат, насыщенный раствор (в случае необходимости его очищают от следов железа, растворяя 500 г в 1 л воды при 37 °С). К прозрачной надосадочной жидкости добавляют раствор батофенантролина из Расчета 10 мл на 1 л и этиловый спирт в количестве, равном количеству надосадочной жидкости; на холоде выпадают кристаллы СН3СООNа × 3Н2О.

3. Батофенантролин, 40 мг в 100 мл этанола.

4. НСl 1 н раствор.

5. Калибровочный раствор железа: 100 мг мягкой железной проволоки растворяют в 4 мл концентрированной НСl и разводят до 1 л водой, получается раствор, содержащий 100 мкг/мл. Из него разведением в 60 раз получают раствор, содержащий 30 мкмоль/л (1,67 мкг/л).

Учитывая, что метод определения очень чувствительный, необходимо принять все меры, чтобы реактивы и посуда не содержали железа, присутствие которого выявляется при постановке холостых проб. Посуду, в том числе пробирки для взятия крови, необходимо обрабатывать разбавленной НСl; должна использоваться только деионизированная или перегнанная в стеклянной посуде вода; реактивы очищаются перекристаллизацией.

Ход исследования

К 0,7 мл сыворотки прибавляют 2 капли тиогликолевой кислоты, взбалтывают, а затем еще 0,35 мл 1 н НСl, опять перемешивают и прибавляют 0,2 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Энергично размешивают стеклянной палочкой в течение 45 с, а затем центрифугируют при скорости 2500 об./мин. В пробирку с притертой пробкой отбирают из надосадочной жидкости 0,7 мл, к которым прибавляют 0,6 мл насыщенного раствора аммония ацетата и 0,7 мл раствора батофенантролина. Окраска развивается за 20–30 с. Фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 536 нм против холостой пробы, в которой вместо сыворотки берут 0,7 мл воды. Одновременно обрабатывают и калибровочную пробу, в которой вместо сыворотки используют 0,7 мл калибровочного раствора, содержащего 30 мкмоль железа в 1 л.

Расчет проводят по правилу пропорций.

Определение железосвязывающей способности сыворотки крови

Принцип метода

Исследуемую сыворотку выдерживают с раствором трехвалентного железа, при этом весь трансферрин насыщается. Избыток солей железа удаляют адсорбцией на карбонате магния и определяют содержание железа в надосадочной жидкости одним из приведенных выше методов.

Необходимые реактивы

1. Железо хлорное, 5 мг/мл: 2,42 г FeCl3 × 6H2O растворяют в 100 мл 0,005 н HCl.

2. Магния карбонат в порошке.

3. Все реактивы, необходимые для определения сывороточного железа одним из описанных выше методов.

Ход исследования

К 2 мл исследуемой сыворотки добавляют 4 мл раствора хлорного железа и тщательно перемешивают. Через 5 мин прибавляют порошок магния карбоната в объеме примерно 0,5 мл, встряхивают в течение 10–15 с и центрифугируют. В надосадочной жидкости определяют железо одним из описанных выше методов. Полученный результат умножают на 3 (разведение сыворотки).

Определение железа в моче по цветной реакции с сульфонированным батофенантролином

Принцип метода

Моча минерализуется с серной кислотой, образовавшийся пирофосфат железа разрушается гидролизом на кипящей водяной бане, раствор нейтрализуется ацетатом аммония, железо восстанавливается сульфатом гидразина, и проводится цветная реакция с сульфонированным батофенантролином.

Необходимые реактивы

1. Кислота серная концентрированная.

2. Перекись водорода, 30%-ный раствор в воде (пероксид).

3. Сульфат гидразина, насыщенный раствор: 2,5 г вещества заливают 100 мл воды.

4. Аммония ацетат, насыщенный раствор: к 148 г соли добавляют 100 мл воды.

5. Раствор сульфонированного батофенантролина.

6. Калибровочный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/л.

Ход исследования

В колбу Кьельдаля помещают 5 мл исследуемой мочи и 1 мл концентрированной серной кислоты и нагревают на электрической плитке с закрытой спиралью или на песчаной бане; не должно быть бурного кипения и образования