Юрий Скрипкин - Инфекции, передаваемые половым путем Страница 29

Комплемент растворяют согласно указанию на этикетке, вводят в дозе 0,05 мл в опыт. Так, для исследования 50 сывороток крови необходимо 0,05 мл х 55, т. е. 2,75 мл комплемента. Взвесь эритроци­тов готовят так: применяется только цитратная кровь донора 0(1) группы, которую взбалтывают до получения однородной смеси, наливают в центрифужные пробирки и трижды отмывают изотони­ческим раствором натрия хлорида. Надосадочная жидкость должна быть прозрачной и негемолизированной. Из осадка отмытых эрит­роцитов готовят 50 % взвесь их в изотоническом растворе натрия хлорида, которую наливают в пробирки в дозе 0,1 мл для каждой испытуемой сыворотки. Расчет необходимого количества эритроци­тов для 50 сывороток производят следующим образом: 0,1 мл х 55, получается 5,5 мл (в данном случае 3 мл отмытых эритроцитов и 3 мл изотонического раствора).

Техника постановки. Предварительно для реакции разво­дят все ингредиенты. На дно центрифужной пробирки микропипет­кой наливают 0,05 мл испытуемой сыворотки, добавляют 0,35 мл смеси комплемента (0,05 мл) с антигеном (0,3 мл). Пробирки энер­гично встряхивают в течение 30 с и оставляют при комнатной тем­пературе на 30 мин; затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл взвеси эритроцитов, пробирки энергично встряхивают в течение 30 с и оставляют в термостате при температуре 37°С на 30 мин, после чего все пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 3 мин.

Учет результатов проводят путем подсчета бледных трепонем в надосадочной жидкости. Для этого 0,01 мл надосадочной жидкости микропипеткой наносят на предметное стекло, покрывают покров­ным стеклом и в темном поле зрения подсчитывают число бледных трепонем в 10 полях зрения. Для облегчения подсчета рекомендуется использовать 11-клавишный лейкоцитарный счетчик. При этом на первой клавише (слева) учитывается число полей зрения, а на пос­ледней клавише (справа) – число трепонем в 10 полях зрения. При просмотре препарата под микроскопом учитываются только те блед­ные трепонемы, которые могут свободно перемещаться с током жидкости. Те же трепонемы, которые попали в поле зрения с током жидкости дополнительно, после начала подсчета («приплывшие»), в этом поле зрения уже не учитываются. Процент прилипания блед­ных трепонем исчисляется по формуле:

(100 – Оn) /K х 100,

где On – число бледных трепонем в 10 полях зрения из опытной пробирки; К – число бледных трепонем в 10 полях зрения из конт­рольной пробирки.

При иммунном прилипании бледных трепонем, равном 0-20%, результат расценивается как отрицательный; 21-30% – как сомнительный; 31-50 % – слабоположительный и при 51-100%-как положительный. В ответе результат реакции выписывается без ука­зания процента. В случае несовпадения результатов РИП сданными других реакций необходимо провести повторный учет результатов РИП с вновь приготовленным препаратом, повторить постановку реакции с этой же сывороткой крови, при необходимости повто­рить РИП с сывороткой крови, взятой у обследуемого повторно.

РИП следует применять в следующих случаях: при диагностике тех форм сифилиса, когда на основании данных анамнеза, клини­ки, результатов КСР и других исследований не удается подтвердить диагноз заболевания; при дифференцировании неспецифических ре­зультатов КСР; при контрольном наблюдении после окончания ле­чения. Специфичность и чувствительность РИП близки РИБТ и РИФ.

Реакция гемагглютинации с бледными трепонемами (ТРПГА). Принцип метода заключается в следующем: формалинизированные тонизированные бараньи эритроциты соединяются с экстрак­том из патогенных бледных трепонем. Образующийся комплекс, который фиксируется на эритроцитах, составляет корпускулярный антиген. При соединении антигена с сывороткой, содержащей гомологичные антитела, образуется иммунный комплекс, который вызывает агглютинацию эритроцитов. Антигеном для этой реакции являются эритроциты барана или индюка, покрытые частицами блед­ных трепонем от зараженных кроликов, а затем фрагментирован-ные ультразвуком. Адсорбирующий разбавитель (состоит из фраг­ментов эритроцитарных мембран барана либо индюка и быка, тре­понем Рейтера, ткани семенников кролика, кроличьей сыворотки) заливают в лунки пластин, куда затем вносят инактивированную сыворотку. Разбавитель связывает неспецифические групповые ан­титела. Специфические иммуноглобулины к бледным трепонемам вызывают агглютинацию. Предварительный результат может быть зарегистрирован после инкубации в течение 3-4 ч. Появление равно­мерной розовой окраски указывает на положительный результат, а агглютинат (преципитат) темно-красного цвета в виде пятна или кольца является показателем осаждения эритроцитов. ТРПГА-тест, выполняемый вручную или автоматизированным методом, являет­ся достаточно специфичным и чувствительным тестом.

Реакция микрогемагглютинации с бледными трепонемами (МНА-ТР) является вариантом ТРПГА. Ее ставят на пластинках для мик­ротитрования. Она требует по сравнению с ТРПГА намного мень­шего количества сыворотки, адсорбирующего разбавителя и анти­гена. Окончательный результат получают уже после 4 ч инкубирования сыворотки. Автоматизированная реакция микрогемагглютина­ции с бледными трепонемами (АМНА-ТР) благодаря автоматиза­ции процессов заполнения тест-пластин и разведения сыворотки еще проще и обходится еще дешевле, чем реакция АМН-ТР. Она особенно пригодна при массовых обследованиях на сифилис.

Клиническая оценка результатов серологических реакций.

При первичном серонегативном периоде сифилиса бывают по­ложительными РИФ и реакция Колмера как наиболее чувствительные серореакции. Однако это не является основанием для постанов­ки таким больным диагноза первичного серопозитивного сифилиса. У ряда больных в этом периоде бывает изолированный положитель­ный результат при постановке реакции Вассермана с трепонемны-ми или с кардиолипиновым антигенами. В конце 3-й или в течение 4-й недели после появления первичной сифиломы становятся поло­жительными стандартные серологические реакции – с этого мо­мента начинается первичный серопозитивный период сифилиса. На 1-2-й неделе первичного серопозитивного сифилиса отмечается уве­личение степени позитивности серореакции (1+, 2+, 3+) и нарас­тание титра реагинов (1:5, 1:10, 1:20). РИФ и реакция Колмера уже у всех больных дают резко положительный результат, но РИБТ, как правило, отрицательная или процент иммобилизации очень низок. Диагноз первичного серопозитивного сифилиса ставится и тем боль­ным, у которых осадочные реакции и реакция Вассермана с неспе­цифическими антигенами дали даже однократный слабоположитель­ный результат. При дальнейшем течении первичного сифилиса все серологические реакции становятся резко положительными (4+); титр реагинов достигает 1:80, 1:160, РИФ продолжает быть резко положительной, но РИБТ у большинства больных еще остается отрицательной или может стать слабоположительной.

При вторичном свежем сифилисе резко положительный резуль­тат по всем стандартным серологическим реакциям наблюдается почти в 100% наблюдений; титр реагинов наиболее высок – 1:160; 1:240 или 1:320. РИФ – 4+; РИБТ дает положительнй результат более чем у половины больных, однако процент иммобилизации трепо-нем невысок (40-60%).

При вторичном рецидивном сифилисе положительный результат по стандартным серологическим реакциям отмечается в 96-98% на­блюдений. Отрицательные результаты могут иногда объясняться малосимптомным рецидивным течением, наличием астенизации и со­четанием сифилиса и ВИЧ-инфекции. РИБТ дает положительный результат у 85-90% больных при выраженной степени иммобилиза­ции – 80-90-100%.

Третичный сифилис характеризуется положительными резуль­татами по стандартным серологическим реакциям в 50-90% наблю­дений и положительной РИБТ у 92-100% пациентов с высоким процентом иммобилизации.

Диагноз скрытого серопозитивного сифилиса, как указывалось выше, устанавливают только по положительным серореакциям в крови с обязательным подтверждением их по РИБТ, так как только РИБТ (и в меньшей степени РИФ) позволяет отдифференцировать ложноположительные серореакции (даже с позитивностью в 2+ или 3+) от истинно положительных.

Разные формы сифилиса нервной системы и висцерального си­филиса имеют различную частоту и выразительность стандартных серореакции. Так, прогрессивный паралич в 100% случаев сопро­вождается резко положительными всеми стандартными серологи­ческими реакциями. Сифилис сосудов мозга, спинная сухотка, си­филитическое поражение сердечно-сосудистой системы сопровож­даются положительными серореакциями лишь в 40-50-60% наблю­дений. Однако РИБТ почти при всех перечисленных патологичес­ких состояниях дает резко положительный результат (90-100% им­мобилизации).

При диагностировании врожденного сифилиса в первые 2 мес после рождения стандартные серологические реакции у ребенка не определяют, т. к. они могут быть положительными за счет пассив­ной передачи реагинов через плаценту. По этой же причине не име­ет значение и положительный результат РИБТ. Пассивно передан­ные от матери ребенку имобилизины самопроизвольно исчезают в течение 6 мес после рождения. Если ребенок инфицируется неза­долго до родов, то в этом случае РИБТ будет еще отрицательной (в связи с более поздним образованием иммобилизинов), несмотря на наличие в организме ребенка сифилитической инфекции.