Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге - Коллектив авторов Страница 25

Снижение содержания кислоты в сыворотке крови отмечается при анемии, после приема пиперазина, атофана, салицилатов и АКТГ.

Методы исследования пигментного обмена

В основе образования билирубина лежит деградация гема гемоглобина и других гемсодержащих белков и ферментов. Гем распадается до биливердина, который восстанавливается в билирубин.

Свободный билирубин токсичен, не растворяются в воде и циркулирует в крови в комплексе с альбуминами. Этот билирубин дает непрямую реакцию Ван ден Берга (после осаждения альбуминов спиртом), поэтому называется непрямым.

Непрямой билирубин, будучи связанным с альбуминами, не проходит через неповрежденные мембраны почечных клубочков и не фильтруется в мочу.

Выведение билирубина осуществляется с желчью через кишечник. Билирубин, связанный с альбуминами, доставляется кровью в печень. Билирубин легко проникает через мембраны гепатоцитов, альбумины остаются в кровотоке.

В гепатоцитах билирубин подвергается конъюгации с глюкуроновой кислотой, превращаясь в билирубинмоно– и диглюкуронид.

Образованные билирубинглюкурониды нетоксичны, легко растворимы. Они направляются с желчью в кишечник для выведения из организма.

Из кишечника билирубинглюкурониды частично поступают в кровоток и, находясь в крови, представляют собой фракцию прямого билирубин, который дает прямую реакцию Ван ден Берга. Прямой билирубин в отличие от непрямого легко проникает через почечные фильтры и может выделяться с мочой.

В физиологических условиях сыворотка крови содержит примерно 25% прямого билирубина (связанного с глюкуроновой кислотой) и 75% непрямого билирубина (альбумин-билирубина).

Таким образом, общий билирубин крови представляет собой суммарное количество непрямого и прямого билирубина.

У здоровых людей в сыворотке крови содержится: общего билирубина 3,4–20,5 мкмоль/л; прямого (конъюгированного) – 0,86–5,3 мкмоль/л; непрямого (свободного) – 1,7–17,1 мкмоль/л.

Для определения билирубина используется колориметрический метод, основу которого составляет реакция Ван ден Берга. Реакция протекает в 2 стадии: на первой под воздействием соляной кислоты разрывается тетрапирроловая цепь, в результате чего образуются два дипиррола, на второй – оба дипирроловых производных диазотируются диазофенилсульфоновой кислотой с превращением их в азобилирубин. Фракционное содержание билирубина определяется с помощью модифицированного метода Ван ден Берга, предложенного Ендрассиком. Метод принят в качестве унифицированного.

Принцип метода Ван ден Берга

Билирубин вступает в реакцию азосочетания с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием раствора азокрасителя. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию билирубина и выявляется фотометрически.

Оригинальным методом Ван ден Берга устанавливается лишь характер реакции (прямая, непрямая, замедленная), т. е. отмечается преобладание в сыворотке крови того или иного билирубина. Метод Ендрассика, Клеггорна и Грофа дает возможность фракционно определять содержание билирубина. Он прост, удобен в практике, не связан с применением дефицитных реактивов и является наиболее приемлемым для практических лабораторий.

Определение рекомендуется проводить сразу же после забора проб, чтобы избежать окисления билирубина на свету. Гемолиз сыворотки снижает количество билирубина пропорционально присутствию гемоглобина. Следовательно, сыворотка крови не должна быть гемолизирована.

Унифицированный метод по диазореакции в присутствии акселератора (метод Ендрассика—Клеггорна—Грофа)

Принцип метода

Под воздействием НСl разрывается тетрапирроловая связь билирубина, в результате чего образуются два дипиррола, которые диазотируются диазобензосульфоновой кислотой с образованием розово-фиолетового азобилирубина. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный билирубин реагирует после добавления кофеинового реактива.

Необходимые реактивы

1. Кофеин.

2. Натрия бензоат.

3. Натрия ацетат 3-водный.

4. Кофеиновый реактив: 5 г кофеина, 7,5 г бензоата натрия, 12,5 г ацетата натрия растворяют в 90 мл воды, нагревают до температуры 50–60 °С, хорошо перемешивают. После охлаждения доливают водой до 100 мл. Раствор стабилен в течение 2 недель.

5. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (изотонический раствор): 0,9 г хлорида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают до метки водой.

6. НСl концентрированная.

7. Сульфаниловая кислота.

8. Диазосмесь. Диазореактив I: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300–400 мл воды, прибавляют 15 мл концентрированной НСl. Если сульфаниловая кислота полностью не растворяется, колбу помещают в теплую воду и помешивают. Только после растворения и охлаждения раствор доливают водой до 1 л. Реактив стабилен при хранении в посуде из темного стекла. Диазореактив II – натрия нитрит, 5 г/л (0,07 моль/л): 0,5 г нитрита натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают водой до метки. Реактив стабилен в течение 2–3 недель при хранении в посуде из темного стекла. Перед работой смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II.

9. Билирубин для построения калибровочного графика, 800 мг/л, или 1368 мкмоль/л. Коммерческие препараты кристаллического билирубина содержат разные примеси, которые могут мешать реакции азосочетания. Рекомендуется использовать набор Био-Ла-Тест «Билирубин-эталон», содержащий билирубин высокой степени чистоты с коэффициентом молярной экстинкции не менее 6,05 × 104 л при 453 нм и растворении в хлороформе. Растворы билирубина нестойкие, поэтому их готовят с добавлением белка в качестве стабилизатора. Коммерческие препараты билирубина не связаны с глюкуроновой кислотой.

10. Натрия карбонат, 0,1 моль/л: 10,6 г безводного NаСО3 растворяют и доливают до 1 л водой.

11. Уксусная кислота, 4 моль/л: 25 мл ледяной уксусной кислоты доливают до 100 мл водой.

Ход определения

В 3 пробирки (2 опытные пробы и холостая) вводят реактивы, как указано в таблице 10.

Таблица 10

Диазореакция

Для определения связанного билирубина измерение проводят спустя 5–10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют стоять 20 мин, после чего измеряют на фотометре. При дальнейшем стоянии окраска не изменяется.

Измерение проводят при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при измерении общего и связанного билирубина, вычитают показатель холостой пробы.

Расчет производят по калибровочному графику. Находят содержание общего и связанного билирубина.

Построение калибровочного графика

Способ I – Шелонга—Венде с использованием стабилизирующего свойства белка сыворотки крови. Основной раствор билирубина: в колбе вместимостью 50 мл растворяют 40 мг билирубина в 30–35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия Na2CO3. Хорошо взбалтывают, не допуская образования пузырьков.

Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором Nа2СО3 и несколько раз перемешивают. Раствор стоек только в течение 10 мин от начала приготовления. В дальнейшем происходит окисление билирубина.

Рабочий раствор билирубина: к 13,9 мл свежей негемолизированной сыворотки здорового человека добавляют 2 мл свежеприготовленного основного раствора билирубина и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Хорошо перемешивают.

При этом выделяются пузырьки углекислого газа. Рабочий раствор стоек в течение нескольких