Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге - Коллектив авторов Страница 33

4. Субстратно-буферный раствор: в пробирку наливают 10 мл воды, добавляют 0,028 г L-γ-глутамил-п-нитроанилида и 0,082 г хлорида натрия и, не переставая мешать, растворяют содержимое пробирки на кипящей водяной бане в течение 60 с. Затем раствор охлаждают до температуры 37 °С и добавляют 2,5 мл буферного раствора.

Приготовленный раствор субстрата во время работы хранят в водяной бане при 37 °С. Неиспользованный раствор субстрата можно хранить в холодильнике в течение недели. Субстрат плохо растворим и при комнатной температуре выпадает в осадок. Поэтому перед употреблением выкристаллизовавшийся субстрат растворяют нагреванием в кипящей водяной бане. Нагревание и растворение субстрата можно повторить не более 2 раз.

5. Уксусная кислота ледяная, раствор 100 г/л: 10 мл кислоты доводят водой до 100 мл.

6. Основной калибровочный раствор п-нитроанилина: 0,0829 г п-нитроанилина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки водой и растворяют. Для определения активности γ-ГТФ можно пользоваться набором реактивов «Лахема».

Ход определения

Опытная проба: в пробирку вносят 0,5 мл раствора субстрата и помещают в водяную баню при температуре 37 °С, приливают 0,05 мл сыворотки крови; содержимое перемешивают и инкубируют точно 15 мин при температуре 37 °С. Затем прибавляют 3 мл раствора уксусной кислоты и перемешивают. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм или на ФЭК при длине волны 400–500 нм (фиолетовый или синий светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 1 см против холостой пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов.

Расчет активности производят по калибровочной кривой. Построение калибровочной кривой: из основного калибровочного раствора готовят рабочие растворы так, как указано в таблице 17.

Таблица 17

Определение активности γ-глутамилтранспептидазы

В каждую из шести пробирок наливают по 0,05 мл рабочих калибровочных растворов № 1–6, прибавляют по 3,5 мл раствора уксусной кислоты, перемешивают и измеряют экстинкцию против раствора уксусной кислоты при тех же условиях, что и опытную пробу. По полученным значениям экстинкции строят калибровочную кривую. Линейность калибровочного графика сохраняется до активности 5000 нмоль/(с × л).

Клинико-диагностическое значение

Значительное повышение активности ГГТП имеет место при обструктивных поражениях печени, внепеченочной обтурации желчных протоков. Повышение активности возникает при таких заболеваниях печени, как цирроз, гепатит, при инфекционном мононуклеозе, пересадке почки, гипертиреоидизме, сахарном диабете, панкреатите, алкоголизме, при раке поджелудочной железы, раке предстательной железы, гепатоме.

Метод исследования активности креатинкиназы (КК)

КК катализирует обратимую реакцию образования креатинфосфата из креатина и АТФ. Креатинфосфат является макроэргическим фосфатом, используемым мышцами для сокращения, расслабления и транспортировки метаболитов. Молекулы КК имеют свои особенности распределения в организме. Существуют 3 активных изофермента КК: мышечный изоэнзим-КК-ММ, сердечный изоэнзим-КК-МВ, мозговой изоэнзим-КК-ВВ.

Установлено, что в сыворотке крови здоровых людей активность ММ-изофермента составляет около 95% общей активности КК, около 5% приходится на активность КК-МВ. При остром инфаркте миокарда спустя 4–6 ч после развития очага повышается активность КК. Максимум активности КК выявляется в течение 12–36 ч, увеличение активности происходит в основном в результате подъема активности КК-МВ.

Принцип метода

Креатинкиназа катализирует превращение креатинина в креатинфосфат. Ион фосфата, освобожденный при гидролизе креатинфосфата, определяют после депротеинирования как желтый комплекс фосфорно-ванадиево-молибденовой кислоты.

Посуда для определения креатинкиназы не должна содержать следы фосфатов.

Повторные внутримышечные инъекции могут вызвать значительное повышение концентрации креатинкиназы в сыворотке крови.

Пределы активности:

1) мужчины – 10–65 Ед/л × 0,017 или 0,17–1,11 мккат/л;

2) женщины – 7–55 Ед/л × 0,017 или 0,12–0,94 мккат/л.

Необходимые реактивы

1. Аденозин-5-трифосфорной кислоты динатриевая соль.

2. L-цистеин, 0,024 моль/л: 2,9 мг растворяют в 1 мл воды. Готовят раствор перед употреблением. На одну пробу требуется 0,1 мл.

3. Креатин.

4. Магния сульфат 7-водный.

5. Аммоний молибденовокислый 4-водный, 0,02 моль/л: 2,5 г молибденовокислого аммония растворяют в мерной колбе в 70–80 мл воды и доводят объем до 100 мл водой.

6. Натрия сульфат безводный.

7. Натрий пиросернистокислый (метабисульфит натрия).

8. 1-амино-2-нафтол-4-сульфокислота (эйконоген).

9. Серная кислота, 2,5 моль/л.

10. НСl, 0,1 моль/л.

11. Трис-(оксиметил)-аминометан (трис).

12. Трис-буфер, 0,133 моль/л, рН 9,0: 1,61 г трис растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в 50–60 мл воды, устанавливают рН буфера 0,1 моль/л раствором НСl и доводят водой до метки.

13. Раствор эйконогена: 15,36 г пиросернистокислого натрия, 0,512 г сернистокислого натрия и 0,128 г эйконогена растворяют в 70–80 мл воды, взбалтывают, доводят объем водой в мерной колбе до 100 мл и дважды фильтруют (через 2 ч и через сутки после приготовления). Раствор следует беречь от яркого света; в случае выпадения осадка вновь фильтруют. Стабилен в течение 1 месяца при хранении в холодильнике.

14. Основная смесь реактивов, содержащая 0,02 моль/л сульфата магния, 0,033 моль/л креатина и 0,0067 моль/л АТФ: 0,4920 г сульфата магния, 0,4326 г креатина и 0,3692 г АТФ растворяют в 70–80 мл трис-буфера (для полного растворения креатина смесь нагревают в течение 5–10 мин на водяной бане при температуре 40–45 °С). Затем объем основной смеси реактивов доводят трис-буфером в мерной колбе до 100 мл.

15. Трихлоруксусная кислота, 4,9 моль/л: 80 г ТХУ растворяют в 50–60 мл воды и объем раствора доводят в мерной колбе до 100 мл.

16. Смесь растворов для проведения кислотного гидролиза креатинфосфата. Смесь готовят перед употреблением, учитывая, что на одну пробу расходуют 2 мл. Смесь состоит из 0,25 мл раствора молибденовокислого аммония, 0,25 мл раствора серной кислоты и 1,5 мл воды (соотношение 1 : 1 : 6).

17. Калия фосфат однозамещенный безводный (для приготовления калибровочного раствора): 0,0169 г КН2РО4 растворяют в воде и объем раствора доводят в мерной колбе до 100 мл.

Специальное оборудование

Фотоэлектроколориметр.

Ход определения

Предварительно все растворы реактивов прогревают в течение 5 мин при температуре 37 °С. Опытная проба: в пробирку вносят 1,5 мл основной смеси реактивов, 0,1 мл раствора цистеина и 0,4 мл сыворотки крови.

Содержимое пробирки осторожно перемешивают и ставят в термостат при температуре 37 °С на 30 мин. Затем прибавляют 0,2 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют при скорости 3000 об./мин в течение 10 мин. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после прибавления раствора трихлоруксусной кислоты. Из опытной и холостой проб забирают по 1 мл надосадочной жидкости и переносят в химические пробирки (маркированные соответствующим образом), в которых содержится по 2 мл