Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге - Коллектив авторов Страница 34

смеси растворов для проведения специфического гидролиза креатинфосфата. Полученную смесь растворов перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин (время гидролиза креатинфосфата). После этого в пробы добавляют с интервалом в 1 минуту по 0,25 мл раствора эйконогена и точно через 15 мин опытную пробу измеряют против холостой пробы при длине волны 600–700 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 0,5 см.

Расчет производят по калибровочному графику. Построение калибровочного графика; готовят калибровочные пробы так, как указано в таблице 18.

Таблица 18

Исследование активности креатинкиназы

Из каждого калибровочного раствора берут по 0,4 мл и обрабатывают так, как опытные пробы. В холостую пробу вместо калибровочных растворов берут по 0,4 мл воды.

Примечание

Если активность КК превышает 500 нмоль/(с×л), то время инкубации сокращают до 15 или 10 мин; полученные величины активности умножают соответственно на 2 или 3. Разбавлять сыворотку не рекомендуется, так как активность фермента при разведении сыворотки изменяется непропорционально.

Клинико-диагностическое значение

Активность общей креатинкиназы повышается при многих заболеваниях: инфаркте миокарда, сахарном диабете, гипотиреозе, мышечных травмах, а также после внутримышечных инъекций, больших физических нагрузок, при дигитализации, хирургических вмешательствах, при мышечных дистрофиях всех типов, инфекционных болезнях, дефибрилляции, застойной сердечной недостаточности, тахикардии, эмболии легочной артерии, генерализованных судорогах, обширном инфаркте мозга, беременности, опухолях предстательной железы, мочевого пузыря, желудочно-кишечного тракта, отеке легкого, остром психозе, травмах головы, инфарктах желудочно-кишечного тракта.

Среди пациентов кардиологического отделения подъем активности КК имеет чувствительность 97%, специфичность 67% для инфаркта миокарда.

Методы исследования активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

Лактатдегидрогеназа – гликолитический фермент, обратимо катализирующий окисление L-лактата в пировиноградную кислоту. Для лактатдегидрогеназы в качестве промежуточного акцептора водорода требуется НАД.

Реакция, катализируемая лактатдегидрогеназой, может быть представлена в следующем виде:

L-лактат + НАД ↔ пируват + НАД Н + Н+.

Фермент широко распространен в организме человека. По степени убывания активности энзима органы и ткани могут быть расположены в следующем порядке: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, сыворотка крови. В последней обнаружено несколько различных белков (изоэнзимов), обладающих каталитическими свойствами этого фермента.

Изменения в строении белковой части изофермента обусловливают их различные физико-химические свойства, что, в частности, сказывается в неодинаковой электрофоретической подвижности разновидностей этого фермента в агаровом, крахмальном, полиакриламидном и других гелях. В сыворотке крови обнаружены 5 изоэнзимов лактатдегидрогеназы: ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4, ЛДГ5, располагающихся в геле в порядке убывания их электрофоретической подвижности.

Установлено, что фракция ЛДГ1 происходит в основном из ткани сердца, ЛДГ5 – из печени.

В отличие от последней ЛДГ1 обладают большей устойчивостью к действию мочевины.

Лактатдегидрогеназа содержится не только в сыворотке, но и в значительном количестве в эритроцитах, поэтому сыворотка, используемая для анализа, должна быть свежей, лишенной следов гемолиза.

Исследование общей активности фермента характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов организма, а определение активности отдельных изоэнзимов ЛДГ способствует диагностике некоторых заболеваний сердца, печени и других органов.

Принцип метода

Лактатдегидрогеназа (L-лактат; НАД-оксидоредуктаза) катализирует превращение лактата в пируват при одновременном восстановлении НАД в НАД(Н), который далее восстанавливает в присутствии N-метилфеназонийметилсульфата йоднитротетразолиевый фиолетовый в красный формазан.

Одновременно с определением общей каталитической активности лактатдегидрогеназы можно определять и долю фермента, устойчивого к действию мочевины, что характерно главным образом для изофермента сердечной фракции.

Пределы активности:

1) ЛДГ при температуре 37 °С – 0,66–2,66 мккат/л;

2) доля фермента, устойчивая к действию мочевины (%), – 60–80.

Необходимые реактивы

1. Молочная кислота 80%-ная.

2. Натрия гидроокись, растворы 2 моль/л; 0,4 моль/л.

3. 0,45 моль/л раствор лактата натрия. В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 5 мл 80%-ной молочной кислоты, добавляют 2 моль/л раствора едкого натра до получения рН 7,5 и доводят объем водой до метки. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике.

4. Натрия пирофосфат (Na4P2O7 × 10 Н2О).

5. НСl 1 моль/л.

6. Натрия пирофосфат 0,03 моль/л, рН 8,8: 6,69 г натрия пирофосфата растворяют в небольшом количестве воды, добавляют 1 моль/л раствор НСl до получения рН 8,8 и доводят объем водой до 500 мл. Стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике.

7. НАД-окисленная форма. Готовят из Расчета 3 мг НАД на 1 мл воды. Раствор стабилен в течение 4 недель при хранении в холодильнике.

8. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина: 19,8 мг 2,4-динитрофенилгидразина растворяют в небольшом количестве 1 моль/л раствора НСl при нагревании на водяной бане. После охлаждения доводят объем 1 моль/л раствором НСl до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла. Стабилен в течение 1 года.

9. Пируват натрия (для построения калибровочной кривой): 11 мг кристаллического пирувата натрия растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой объем раствора до метки; 1 мл раствора содержит 88 мкг пировиноградной кислоты. Рабочий раствор готовят разведением основного раствора в 10 раз бидистиллированной водой; 1 мл рабочего раствора содержит 8,8 мкг пировиноградной кислоты.

Ход определения

Опытная проба: 0,1 мл сыворотки, разведенной 1 : 2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД, прогревают 5 мин при температуре 37 °С. Затем добавляют 0,8 мл 0,03 моль/л раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл 0,45 моль/л раствора лактата натрия, предварительно прогретых при температуре 37 °С, и инкубируют смесь при температуре 37 °С в течение 15 мин. Тотчас после инкубации добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина, выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл 0,4 моль/л раствора едкого натра, перемешивают и через 10 мин измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет активности производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из рабочего калибровочного раствора пирувата натрия готовят ряд разведений, как указано в таблице 19.

Таблица 19

Исследование активности лактатдегидрогеназы

Затем в пробирки приливают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Далее калибровочные пробы обрабатывают и измеряют так же, как опытные. Холостую пробу ставят так же, как калибровочную, но вместо калибровочного раствора добавляют воду. Линейная зависимость между концентрацией пировиноградной кислоты и оптической плотностью сохраняется от 0 до 3000 нмоль/(с × л).

Клинико-диагностическое значение

Активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови возрастает при повреждении миокарда, лейкозах, почечных заболеваниях, гемолитической, серповидно-клеточной анемиях, тромбоцитопениях, инфекционных мононуклеозах, а также прогрессивной мышечной дистрофии. Все заболевания, протекающие с некрозом тканей (инфаркт миокарда, некротические поражения почек, гепатиты, панкреатиты,