Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге - Коллектив авторов Страница 40

обмена кальция, является остеопороз. Это системное заболевание скелета, характеризующееся снижением массы костей и нарушениями в их строении, которые приводят к значительному увеличению хрупкости костей и возможности их переломов. У здоровых людей старше 20–25 лет с возрастом происходит уменьшение костной массы со скоростью 0,5–1% в год. У женщин в постменопаузе, а также у мужчин и женщин старческого возраста среднее уменьшение массы костей может составить 3–5% и более в год. Риск развития остеопороза повышают такие факторы, как дефицит эстрогенов (особенно в постменопаузе), недостаток кальция и витамина D в пище, алкоголь, курение, гиподинамия.

При первичном остеопорозе уровень кальция в крови остается, как правило, в норме. При вторичном остеопорозе, который возникает в результате нарушения кальциевого обмена под действием лекарственных веществ и глюкокортикоидов, при нарушениях всасывания кальция в кишечнике, выделения почками, концентрация кальция в крови снижена.

Увеличение концентрации кальция в крови наблюдается при гиперфункции или опухолях паращитовидных желез и повышенном образовании паратиреоидного гормона, а также при различных злокачественных опухолях с метастазами в кости и заболеваниях крови (миеломная болезнь, лимфома, лимфосаркома). Уменьшение продукции паратиреоидного гормона (по разным причинам) сопровождается снижением концентрации кальция в крови.

Предложено много химических методов определения кальция в сыворотке крови и в моче; они основаны главным образом на способности образовывать окрашенные соединения с комплексонами, т. е. веществами, образующими прочные комплексы с металлами. Здесь можно выделить 2 подгруппы – либо общее количество комплекса непосредственно определяется фотометрией, либо окрашенный комплекс используется лишь как индикатор конца титрования. Методы второй группы сейчас практически не находят применения.

Основными методами определения общего кальция являются:

1) метод Вилькинсона – титрование ЭДТА в присутствии мурексида;

2) калориметрический метод с использованием креозолфталеина;

3) калориметрический метод с использованием метил-тимолового голубого;

4) флуореметрический метод с использованием кальцеина;

5) пламенная эмиссия;

6) референсный метод (атомно-абсорбционная спектрофотометрия).

Посуда для выполнения анализа должна быть изготовлена из материала, который не содержит ионы кальция. Проба берется натощак, сыворотку быстро отделяют от сгустка.

Унифицированный метод по цветной реакции с крезолфталеинкомплексоном

Принцип метода

Крезолфталеинкомплексон образует с кальцием в щелочной среде комплекс красно-фиолетового цвета, интенсивность окраски пропорциональна концентрации кальция. В реакционную смесь добавляют 8-оксихинолин, который связывает металлы, мешающие определению, но образует с кальцием менее прочный комплекс, чем крезолфталеинкомплексон.

Необходимые реактивы

1. Боратный буфер: 200 г борной кислоты (Н3ВО3, ортоборная кислота) растворяют при нагревании в 300 мл воды, добавляют 580 мл 5 н КОН, объем доводят водой в мерной колбе до 1 л, при температуре ниже 56 °С из раствора могут выпадать кристаллы.

2. Глицин 2 моль/л: 7,5 г глицина растворяют в 40 мл воды, переносят в мерную колбу и доводят объем до 50 мл, для консервации добавляют 2 капли хлороформа, хранят в холодильнике.

3. 8-оксихинолин (оксин), 1%-ный раствор: 500 мг препарата растворяют в 50 мл абсолютного спирта.

4. Рабочий буферный раствор: к 300 мл воды добавляют 12,5 мл боратного буфера и 5 мл раствора глицина, перемешивают и устанавливают величину рН в пределах 10,5–10,6 с помощью 5 н КОН, добавляют 50 мл 1%-ного раствора оксихинолина, переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл и доводят до метки водой, после чего снова проверяют рН.

5. Крезилфталеинкомплексон, 0,1%-ный раствор: 10 мг крезолфталеинкомплексона растворяют в 100 мл основного буферного раствора (при хранении в холодильнике реактив стоек не более 2–3 дней); калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий кальций в концентрации 25 ммоль/л, готовят, растворяя 250 мг кальция карбоната (СаСО3) в 5 мл 1 н НСl. Раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. Для консервации добавляют 2 капли хлороформа. Одновременно готовят раствор соли магния 3 мг/мл, растворяя 2,5 г хлорида магния (MgCl2 × 6Н2О) в 100 мл воды. Из этих растворов готовят рабочие калибровочные растворы согласно таблице 26.

Таблица 26

Определение кальция по цветной реакции с крезолфталеинкомплексоном

Ход исследования

К 3 мл рабочего раствора крезолфталеинкомплексона добавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки, перемешивают.

Через 5 мин фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 0,5 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против рабочего раствора крезолфталеинкомплексона. Одновременно обязательно ставят хотя бы одну калибровочную пробу. Расчет ведут по калибровочной кривой либо по правилу пропорций.

Некоторые сорта стекла могут выщелачиваться, отдавая в раствор соли кальция, поэтому лабораторную посуду, особенно пробирки, желательно предварительно прокипятить в соляной кислоте. Определение желательно проводить в сыворотке или в плазме, полученной из гепаринизированной крови, так как щавелевая, лимонная кислоты и другие антикоагулянты, связывающие кальций, могут помешать определению.

Метод определения кальция по цветной реакции с глиоксаль-бис-2-оксианилом

Принцип метода

Глиоксаль-бис-2-оксианил образует с кальцием в щелочной среде окрашенный комплекс красного цвета, интенсивность которого пропорциональна концентрации кальция.

Необходимые реактивы

1. Метиловый спирт (метанол), безводный.

2. Глиоксаль-бис-2-оксианил (ГБОА), 0,05%-ный раствор в метаноле, 50 мг препарата растворяют в 100 мл этанола (раствор нестойкий).

3. Боратный буфер рН 12,6 – растворяют в воде 10 г едкого натра (NaOH) и 10 г тетрагидробората натрия (Na2B4O7 × 10Н2О), объем доводят до 1 л в мерной колбе.

4. Ацетон.

5. Смесь метанола и ацетона 9 : 1 (по объему).

6. Калибровочные растворы. Основной калибровочный раствор, содержащий 25 ммоль/л Са, готовят растворяя 100 мг карбоната кальция (СаСО3) в 5 мл 1 н НСl и доводя объем раствора до 100 мл водой в мерной колбе. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы с концентрацией 1,5–3,5 ммоль/л, отбирая 6–14 мл в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводя объем водой до метки (приготовление аналогично методу, описанному в предыдущем методе, но без солей магния).

Ход исследования

К 1,5 мл боратного буферного раствора прибавляют 0,02 мл исследуемой сыворотки и через l,5 мин 0,5 мл 0,05%-ного раствора ГБОА в метаноле и еще через 1,5 мин 1 мл смеси метанола и ацетона. Фотометрируют точно через 5–10 мин после добавления 0,05%-ного раствора ГБОА при длине волны 540–550 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против холостой пробы, в которую вместо исследуемой сыворотки берут воду. Одновременно ставят также калибровочную пробу.
Расчет выполняют по калибровочному графику либо по правилам пропорции.

ГБОА в щелочной среде распадается с образованием анилина и глиоксаля, который затем окисляется в глиоксалевую кислоту, способную образовывать комплексы с кальцием. Даже в растворе абсолютного метанола на протяжении нескольких недель реактив разрушается. Накапливающаяся глиоксалевая кислота в значительно большей степени