Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге - Коллектив авторов Страница 41

Метод определения кальция по цветной реакции с мурексидом в присутствии глицерина

Принцип метода

Мурексид образует с кальцием в щелочной среде окрашенный комплекс, устойчивость которого повышается путем добавления в раствор глицерина.

Необходимые реактивы

1. Мурексидглицериновый реактив – 20 мг мурексида растворяют в 10 мл 4 н КОН, 1 мл этого раствора смешивают с 20 мл смеси из 10 мл воды и 10 мл глицерина.

2. Калибровочные растворы готовят так же, как и в предыдущем методе.

Ход исследования

В 0,3 мл воды вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки, затем туда же добавляют 3 мл мурексидглицеринового реактива, перемешивают и через 5 мин фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 490 нм против холостой пробы, в которой вместо исследуемой сыворотки применяют воду. Одновременно ставят калибровочную пробу, в которую вместо сыворотки берут 0,1 мл калибровочного раствора.

Расчет производят по калибровочному графику.

Определение уровня ионизированного кальция

В современных газовых анализаторах имеется встроенный блок для определения концентрации ионизированного кальция.

Фосфор и фосфорсодержащие вещества

Фосфор находится в организме в форме неорганических фосфатов, в комплексе с липидами (липидный фосфор) и нуклеотидами (кислоторастворимый фосфор). Входит в состав скелета, фосфолипидов мембран, 2,3-дифосфоглицерата (вещества, определяющего способность гемоглобина присоединять кислород), участвует в процессах накопления и освобождения энергии в клетках (в составе АТФ, АДФ, АМФ), в ферментативных реакциях (в составе НАДФ). Поступает с пищей; всасывание в тонком кишечнике фосфора и кальция тесно связано и регулируется кальциферолом. Выведение с мочой зависит от функционального состояния почек.

Нормальная концентрация в крови: фосфор неорганический – 1–2 ммоль/л, фосфор липидный – 2,0–3,5 ммоль/л, в эритроцитах – 3–5 ммоль/л, фосфор кислоторастворимый (эритроциты) – 7–14 ммоль/л, в моче (неорганический фосфор) – 25,8–48,4 ммоль/сутки.

Определение концентрации фосфора в крови чаще всего назначается при нарушениях обмена кальция, так как наибольшее диагностическое значение имеет соотношение количества кальция и неорганического фосфора.

Увеличение концентрации отмечается при почечной недостаточности, передозировке витамина D, недостаточности паращитовидных желез, в некоторых случаях при миеломной болезни, нарушениях липидного обмена (липидный фосфор). Количество кислоторастворимого фосфора увеличивается при всех заболеваниях, сопровождающихся кислородной недостаточностью.

Снижение концентрации происходит при дефиците витамина D, первичном гиперпаратиреозе, диабетическом кетоацидозе, алиментарной недостаточности, респираторном алкалозе, болезни Крона, нарушениях всасывания в кишечнике, рахите, гиперфункции паращитовидных желез.

Определение неорганического фосфора

Унифицированный метод определения фосфора по восстановлению фосфорно-молибденовой гетерополикислоты

Принцип метода

Белки осаждают трихлоруксусной кислотой, в кислой среде фосфорная кислота образует с молибденовой кислотой фосфорно-молибденовую гетерополикислоту, которая восстанавливается эйконогеном с образованием ярко окрашенного молибденового синего.

Необходимые реактивы

1. Кислота трихлоруксусная, раствор 100 г/л (10%-ный).

2. Кислота серная 5 н.

3. Аммоний молибденовокислый, 5%-ный раствор готовят, растворяя 5 г (NH4)6Мо7О2 × 4Н2О в 100 мл 5 н серной кислоты.

4. Натрий кислый сернистокислый NaHSO3 (в такой форме соль существует только в растворе, это скорее коммерческое, нежели химическое название). При кристаллизации выпадает пиросернистокислый натрий (Na2S2O5), который называют также метабисульфитом. Все 3 названия – бисульфит, пиросульфит и метабисульфит – синонимы. Препараты с этими названиями могут быть с равным успехом использованы для определения фосфора.

5. Натрий сернистокислый безводный, сульфид натрия Na2SO3.

6. Эйконоген, раствор. Растворяют полностью 6 г бисульфита натрия в 20–25 мл воды, вносят в этот раствор 0,1 г эйконогена (аминонафтолсульфоновой кислоты), который также должен полностью раствориться, на что уходит некоторое время.

7. Отдельно в небольшом объеме растворяют 1,2 г безводного сернокислого натрия, оба раствора смешивают, доводят объем до 50 мл, дают отстояться несколько часов и фильтруют.

8. Калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий 50 ммоль фосфора в 1 л, готовят, растворяя 702,2 мг высушенного до постоянной массы при температуре 120 °С однозамещенного фосфата калия КН2РО4 в 100 мл воды. Из него готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 1, 2 и 3 ммоль/л. Для этого 1, 2 или 3 мл основного раствора доводят водой до объема 50 мл.

Ход исследования

К 1 мл прибавляют 4 мл воды и 5 мл раствора трихлоруксусной кислоты, через 10 мин центрифугируют или фильтруют. К 5 мл безбелкового фильтрата добавляют 1 мл раствора молибденовокислого аммония, 0,2 мл раствора эйконогена и 1,8 мл воды. Через 20 мин фотометрируют при длине волны 630–690 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см против холостого опыта. Одновременно ставят холостой опыт, в который вместо исследуемой сыворотки добавляют воду, и калибровочные опыты, в которые вместо сыворотки берут рабочие калибровочные растворы.

Расчет проводят по калибровочному графику или правилу пропорций.

Чувствительность метода можно значительно повысить, если после добавления эйконогена пробы нагревать в течение 7 мин на кипящей водяной бане и фотометрировать при длине волны 830 нм. В этом случае вместо 5%-ного раствора молибденового аммония берут 0,5%-ный раствор в 0,5 н серной кислоте, остальные реактивы те же. Согласно унифицированному методу окончательный объем фотометрируемых проб составляет 8 мл. Если объем кюветы меньше, все дозировки можно пропорционально уменьшить.

Метод определения фосфора по образованию окрашенного комплекса малахитового зеленого с фосфорно-молибденовой кислотой

Принцип метода

Неорганический фосфор образует с молибденовой кислотой фосфорно-молибденовую гетерополикислоту, которая, реагируя с основным красителем – малахитовым зеленым, дает зеленовато-синее окрашивание.

Если фосфора нет, то малахитовый зеленый в кислой среде окрашен в желто-коричневый цвет. Белок не мешает проведению реакции, поэтому депротеинизацию не проводят, для обеспечения коллоидной устойчивости образовавшегося комплекса в раствор добавляется твин 20.

Необходимые реактивы

1. Малахитовый зеленый.

2. Аммоний молибденовокислый.

3. Цветной реактив – 1,5 г малахитового зеленого растворяют в 250 мл воды, одновременно растворяют 10,3 г молибденовокислого аммония в 250 мл 5 н НСl. Оба раствора смешивают, дают отстояться и фильтруют, за это время цвет реактива меняется.

4. Твин 20, 1,5%-ный раствор – 0,15 мл твина 20 разводят 10 мл воды.

5. Калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий 50 ммоль/л, готовят, растворяя 702,2 мг однозамещенного кислого фосфата калия КН2РО4, высушенного при температуре 120 °С до постоянной массы, в 1 л воды. Из него готовят калибровочный раствор, содержащий 20 мкмоль/л.

Ход исследования

0,02 мл сыворотки вносят в 1,5 мл воды, к раствору добавляют 2 мл цветного реактива и 1 каплю 1,5%-ного раствора твина.