Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге - Коллектив авторов Страница 43

этого электрофореграммы высушивают в темноте и рассматривают при освещении коротким ультрафиолетовым светом (длина волны меньше 300 нм, можно пользоваться ультрахемоскопом Блюмберга или другим аналогичным прибором). Бумага слегка флюоресцирует за счет примесей, а адениловые нуклеотиды, которые сильно поглощают свет в этой области, видны в виде темных пятен. Ближе к старту находится АДФ, дальше от старта – АТФ. Контуры пятен обводят карандашом, вырезают и элюируют 5 мл 0,01 н НСl в течение 4 ч. Одновременно экстрагируют аналогичный участок бумаги, не содержащий нуклеотидов; этот раствор используют в качестве холостого опыта. Экстинкции всех растворов измеряются при длине волн 260 и 290 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см, из первой величины вычитают вторую.

Расчет основывается на данных молярного коэффициента экстинкции при длине волны 260 нм, который у разных нуклеотидов несколько различается, однако этими небольшими различиями можно пренебречь и принять его равным 14,2 × 103. Это значит, что такая величина оптической плотности получится, если фотометрировать в кювете с длиной оптического пути 1 см раствор концентрации 1 моль/л и вычесть из этой величины оптическую плотность при 290 нм. Для раствора концентрации 1 мкмоль/л величина будет 0,0142.

В данном методе окончательное разведение пробы в 200 раз (нуклеотиды из 25 мкл эритроцитной массы оказываются в 5 мл), поэтому Расчет производят по формуле:

Е × 200 / 0,0142 = Е × 14 085 мкмоль / л эритроцитарной массы,

где Е – разность оптических плотностей, измеренных при длинах волн 260 и 290 нм.

Нормальные величины: для АТФ – 600–1400 мкмоль/л, для АДФ – 250–800 мкмоль/л, отношение молярных концентраций АТФ / АДФ в норме 2.

Определение адениловых нуклеотидов эритроцитов методом тонкослойной хроматографии

Принцип метода

Белки эритроцитов осаждаются хлорной кислотой, избыток которой удаляется в виде калиевой соли. Безбелковый фильтрат хроматографируется в тонком слое на пластинах «Силуфол», нуклеотиды идентифицируются в ультрафиолетовом свете и определяются по светопоглощению элюатов.

Необходимые реактивы

1. Диоксан.

2. Изопропиловый спирт.

3. Аммиак, концентрированный раствор.

4. Кислота хлорная, 0,8 н (8%-ная НСlО4).

5. Калия карбонат, раствор 2 моль/л готовят, растворяя 27,6 г карбоната калия (поташ, К2СО3) в воде, объем доводят до 100 мл. В случае необходимости препарат предварительно сушат при температуре 105–110 °С.

6. Подвижная фаза для хроматографии – смешивают 40 мл диоксана, 20 мл изопропилового спирта, 40 мл воды и 10 мл концентрированного раствора аммиака. Можно использовать и более простую систему, которую готовят без изопропанола, смешивая 40 мл диоксана, 40 мл воды и 10 мл раствора аммиака.

7. НСl, 0,1 н.

8. Натрия хлорид, 0,85%-ный раствор (изотонический раствор).

9. Пластины для тонкослойной хроматографии «Силуфол».

Ход исследования

Кровь берут с гепарином, добавляя его из Расчета 12 ME на 1 мл крови. Эритроциты отделяют центрифугированием, плазму отсасывают, а клетки 3 раза промывают холодным изотоническим раствором натрия хлорида, каждый раз центрифугируя по 20 мин при скорости 3000 об./мин.

К 1 мл эритроцитной массы добавляют 1 мл раствора хлорной кислоты, перемешивают и через несколько минут осадок отделяют центрифугированием. К 1 мл надосадочной жидкости прибавляют 0,1 мл раствора калия карбоната и оставляют на холоде, пока полностью не выпадут кристаллы образовавшегося перхлората калия. 0,05–0,1 мл холодной надосадочной жидкости (если она согреется, кристаллы частично растворяются) наносят в виде полоски на пластину «Силуфол» и проводят восходящую хроматографию в течение 60–90 мин в смеси диоксана, изопропилового спирта и аммиака.

Перед началом хроматографии камера должна быть насыщена парами растворителя, фронт растворителя должен пройти расстояние не менее 3/4 пластины; если он не пройдет его, то наиболее вероятная причина этого – плохое насыщение камеры парами подвижной фазы или плохая герметизация камеры.

Вынутые из камеры пластины высушивают на воздухе и просматривают в коротком ультрафиолетовом свете (на ультрахемоскопе Блюмберга или другом аналогичном приборе), находят пятна нуклеотидов и обводят их острым предметом. В этой системе быстрее всего движется АМФ, медленнее – АТФ. Порошок с отмеченных мест пластины соскабливают и элюируют 3 мл 0,1 н НСl. Определяют светопоглощение надосадочной жидкости при длине волны 260 нм.

При налаживании методики рекомендуется провести определение в калибровочном растворе, содержащем в 1 мл 30–60 нмоль (15–30 мкг) ампулированного препарата АТФ, который непосредственно наносят на хроматографическую пластину так же, как и нейтрализованный хлорный экстракт. Эти препараты обычно помимо АТФ содержат также АДФ и АМФ.

Расчет проводят исходя из молярных коэффициентов экстинкции: для АТФ – 14 600, для АДФ – 15 000, для АМФ – 14 700. Если для хроматографии было взято 0,1 мл нейтрализованного экстракта и окончательный объем после элюации был 3 мл, разведение составляет 1 : 63, поэтому для того чтобы выразить концентрацию АТФ в мкмоль/л, надо величину умножить на 4315, для АДФ коэффициент составляет 4200, для АМФ – 4286. Если же для хроматографии берут 0,05 мл нейтрализованного экстракта, коэффициенты должны быть в 2 раза выше.

Нормальные величины: содержание АТФ – 726 × 2,4 мкмоль/л, содержание АДФ – 262 × 1,2 мкмоль/л, АМФ – 4,1 × 1,3 мкмоль/л.

Магний

Магний – второй по концентрации после калия внутриклеточный катион, входит в состав ряда ферментов. Наиболее необходим для функционирования сердца, нервной и мышечной ткани. Он содержится в мышечной и костной ткани. Активность многих ферментов зависит от магния.

Нормальная концентрация: в плазме – 0,7–1,2 ммоль/л, в моче – 3–5 ммоль/сутки.

Общее содержание в организме – около 1640 ммоль, из них:

1) в скелете – около 50%;

2) в мышцах – около 30%.

Суточная потребность – 300–400 мг.

Снижение концентрации магния обнаруживается одновременно в крови и моче при больших потерях воды (продолжительные поносы, полиурия при заболеваниях почек, прием мочегонных средств), при нарушениях всасывания в кишечнике, хроническом алкоголизме, в период беременности. Недостаток магния проявляется нарушениями сердечной деятельности, а при значительном дефиците – судорогами.

Избыточное содержание магния отмечается при хронической почечной недостаточности, гипофункции щитовидной железы и вызывает замедление проведения нервного импульса в проводящей системе сердца, блокаду нервно-мышечной передачи.

Методы определения магния во многом близки методам определения кальция, так как и в том и в другом случае на первом месте по точности стоит атомная абсорбция, на втором – химические методы, основанные на образовании окрашенных комплексных соединений.

Хотя магний, подобно кальцию, только частично находится в плазме крови в ионизированном состоянии, а частично связан с белками и низкомолекулярными комплексообразователями – лимонной и фосфорной кислотами, клиническое значение имеет только определение общего магния.

Известно много веществ, образующих окрашенные или флюоресцирующие комплексы с магнием,