Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге - Коллектив авторов Страница 42

Для построения калибровочного графика берут 0,5; 1 и 1,5 мл рабочего калибровочного раствора, т. е. 10, 20 и 30 нмоль фосфора, доводят объем до 1,5 мл, добавляют цветной реактив и раствор твина так же, как в основном опыте. Калибровочная проба, в которую взято 20 нмоль фосфора, по окраске соответствует опытной пробе, у которой взята сыворотка, содержащая фосфор в концентрации 1 ммоль/л. Калибровочные пробы, в которые взято 10 и 30 нмоль, соответствуют сывороткам, содержащим 0,5 и 1,5 ммоль фосфора в 1 л. По этим данным строится калибровочная кривая, которая и используется для Расчета.

Определение липидного фосфора

Унифицированный метод определения фосфора после осаждения белков трихлоруксусной кислотой

Принцип метода

При осаждении белков крови трихлоруксусной кислотой все фосфолипиды осаждаются вместе с белковым сгустком, а неорганический и кислоторастворимый фосфор остаются в растворе. Белковый сгусток минерализуется нагреванием с хлорной кислотой, и фосфор определяется эйконогеновым методом. В связи с тем что белки плазмы не содержат фосфора, весь осаждаемый трихлоруксусной кислотой фосфор входит в состав фосфолипидов.

Необходимые реактивы

1. Кислота хлорная 57%-ная, ее концентрация должна быть 5,7 н, что проверяется титрованием. Если концентрация значительно ниже, что часто случается, так как препарат может содержать 40 или 50% НСlО4, соответственно увеличивается количество реактива, используемого при минерализации.

2. Кислота трихлоруксусная, 100 г/л (10%-ный).

3. Аммоний молибденовокислый, раствор 40 г/л. Готовят, растворяя 4 г (NH4) Mo7O24 × 4H2O в 100 мл воды.

4. Натрий кислый сернистокислый.

5. Натрий сернистокислый безводный.

6. Эйконоген, раствор.

7. Калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий 50 ммоль фосфора в 1 л, разводят водой в 50 раз; получается раствор, содержащий 1 мкмоль/мл.

Ход исследования

К 0,2 мл исследуемой сыворотки добавляют 3 мл воды и медленно 3 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, через 1–2 мин центрифугируют, надосадочную жидкость сливают – пробирку переворачивают и дают стечь жидкости. К осадку добавляют 1 мл 57%-ной хлорной кислоты; если ее концентрация ниже, соответственно увеличивают количество кислоты, переносят в колбу или в большую пробирку для сжигания и минерализуют.

Минерализация – наиболее ответственный этап определения. Дигидрат хлорной кислоты НСlО4 × 2Н2О кипит при температуре 203 °С, при более низкой температуре из пробы удаляют воду, а при повышении температуры начинает улетучиваться сама хлорная кислота. Температурный режим должен быть подобран так, чтобы пары дигидрата хлорной кислоты конденсировались на стенках и в виде капелек опускались на дно, где опять испарялись, и т. д. При оптимальных условиях минерализация заканчивается за несколько часов; если температура слишком низкая, она затягивается, если слишком высокая, хлорная кислота улетучивается, и проба будет испорчена. Лучше всего сжигать пробы в больших пробирках 20 × 200 мм, которые устанавливают в подогреваемом электричеством металлическом блоке (каждую пробирку в отдельном гнезде). Сверху пробирки прикрывают специальными затычками или колпачками, на которых также конденсируются и стекают вниз пары хлорной кислоты. Высота блока должна быть 2–3 см; большая часть пробирки, которая находится над блоком, остается свободной и относительно холодной, на ней и конденсируется хлорная кислота. Желательно, чтобы температура в блоке поддерживалась на уровне 200–210 °С с помощью электронного реле, соединенного с контактным термометром (как в термостате). Такое устройство позволяет сжигать большое количество проб с наименьшими затратами времени лаборанта, но можно работать также с круглодонными колбами с длинными горлышками (колбы Кьельдаля) на песчаной бане, но это требует большего внимания к ходу минерализации. Внешний признак того, что минерализация окончилась, – просветление проб, но он может быть обманчивым. В то же время слишком длительное нагревание приводит к потерям, поэтому перед началом серийных анализов надо отработать режим сжигания, проверяя воспроизводимость в серии.

После охлаждения к минерализованной пробе прибавляют 7 мл воды, 1 мл раствора молибденовокислого аммония и 1 мл раствора эйконогена, объем доводят водой до 10 мл. Через 20 мин фотометрируют в кюветах с длиной оптического пути 1 см при длине волны 630–690 нм против холостого опыта, в который берут 0,8 мл хлорной кислоты, 7 мл воды и далее проводят цветную реакцию так же, как и в опыте.

Для построения калибровочной кривой минерализуют калибровочные пробы, содержащие 0,2–1 мкмоль фосфора. Для этого к ним прибавляют по 1 мл хлорной кислоты и ставят нагревать вместе с опытными пробами, после чего проводят цветную реакцию. По калибровочному графику вычисляют содержание фосфора в пробе, эту величину умножают на 5 и получают концентрацию мкмоль/мл или ммоль/л.

После минерализации образовавшийся неорганический фосфор может быть определен любым методом, в том числе и наиболее чувствительным с малахитовым зеленым. Иногда в процессе минерализации образуется некоторое количество пирофосфата, что приводит к заниженным результатам анализа. В этом случае пробу после разведения водой ставят на несколько минут на кипящую водяную баню, при этом пирофосфат гидролизуется.

Определение фосфонуклеотидов

Определение нуклеотидов эритроцитов электрофоретическим методом

Принцип метода

Белки эритроцитов осаждают трихлоруксусной кислотой, надосадочную жидкость подвергают электрофорезу на бумаге в цитратном буфере рН 5,1. Пятна АТФ и АДФ идентифицируют в ультрафиолетовом свете, вырезают, элюируют и количественно определяют прямой спектрофотометрией в ультрафиолетовом свете при длине волны 260 нм.

Необходимые реактивы

1. Натрия цитрат трехзамещенный.

2. Гепарин, ампулированный препарат, активность 5000 ЕД/мл.

3. Натрия хлорид 0,85%-ный раствор (физиологический раствор).

4. Кислота трихлоруксусная 150 г/л (15%-ный раствор).

5. НСl 0,01 н.

6. Цитратный буфер рН 5,1 готовят, растворяя в воде 17,65 г натрия цитрата трехзамещенного и 4,41 г лимонной кислоты. Объем доводят до 1 л.

7. Бумага для электрофореза, разрезанная на ленты 35 × 200 мм.

Ход исследования

Кровь берут с гепарином из Расчета 0,1 мл на 5 мл крови. Эритроциты отделяют центрифугированием, плазму отсасывают, а клетки дважды промывают изотоническим раствором натрия хлорида при температуре 4 °С, каждый раз центрифугируя, отсасывая надосадочную жидкость и вновь ресуспендируя в новой порции раствора. К 0,5 мл эритроцитной взвеси добавляют 0,5 мл 15%-ной трихлоруксусной кислоты, перемешивают палочкой, выдерживают при температуре 4 °С в течение 10 мин и центрифугируют. Надосадочную жидкость используют для определения нуклеотидов.

Электрофоретическую камеру заполняют цитратным буфером рН 5,1 и смачивают бумагу для электрофореза согласно правилам работы на приборе. На место старта равномерной поперечной полосой наносят 0,05 мл исследуемого трихлоруксусного экстракта и проводят электрофорез при напряжении 12–14 В/см при силе тока 0,5–1 мА на 1 см поперечного сечения ленты в течение 3,5 ч. После