Голографическая интерферометрия и лазерная микроскопия эритроцитов - Александр Николаевич Метелкин Страница 2

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В качестве материала исследования были взяты эритроциты периферической крови здоровых /20/ и больных детей: 5 с сахарным диабетом, 6 с диффузным гломерулонефритом, 12 с наследственным микросфероцитозом в возрасте от 6 до 12 лет. Обследовались эритроциты родственников детей, больных НС. В 2х случаях анализировались эритроциты, выделенные из удаленной по поводу НС селезенки.

Забор крови производился из локтевой вены. Для анализа использовалась гепаринизированная кровь в объеме 0,5+1,0 мл, не позднее чем через час после забора крови. Эритроциты исследовались при комнатной температуре /t =20-22⁰ С/ в аутоплазме или в физиологическом растворе в зависимости от типа эксперимента. Взвесь эритроцитов разделялась на две части. Первая часть /0,1 – 0,3 мл/ помещалась под микроскоп, далее проводилось фотографирование или микрокиносъемка интерферограмм и изображений клеток в лазерном свете. Интерференционные картины, снятые на фотопленку, обрабатывались по разработанным методикам расчёта интерферограмм. Вторая часть эритроцитов /0,3 – 0,4 мл/ отбиралась для измерения на рефрактометре показателя преломления внутри и вне клеток.

Эти данные использовались для обсчёта интерферограмм. Исследования эритроцитов проводились по следующим признакам:

1. Определение максимальной и минимальной толщины, площади поверхности, объема, коэффициента сферичности эритроцитов, массы и концентрации гемоглобина, определение формы эритроцитов по их поперечному сечению, анализ изменения поверхности по данным голографической интерферометрии и лазерной микроскопии в проходящем и отраженном свете.

2. Анализ осмотической резистентности эритроцитов по методу рассеяния лазерного излучения на взвеси эритроцитов в средах различной тоничности.

3. Измерение осмотической силы плазмы и физрастворов по электротермическому методу определения осмотического давления биологических жидкостей /Жуков Б.Н. с соавт., 1972/.

4. Контроль рН физрастворов рНметром.

Обработка результатов проводилась с помощью ЭВМ и калькуляторов, полученные данные, представлялись в виде таблиц, графиков, кривых распределения числа эритроцитов от измеряемых параметров, в виде микрофотографии в лазерном свете /увеличение 2250 раз/, интерферограмм эритроцитов, кино и видеомагнитофонных записей.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Теоретическое обоснование использования методов голографической интерферометрии и лазерной микроскопии. Описание количественных методик анализа параметров эритроцитов данными методами

В основе оптической голографии лежит двухстадийньй принцип записи и восстановления объемного изображения объекта. Для записи изображения требуется наличие двух когерентных пучков света, которые обычно получают разделением луча лазера на светоделительной призме. При взаимодействии с фотослоем регистрирующей пластинки происходит одновременная фотозапись двух пучков: сигнального – прошедшего /или отраженного/ сквозь объект и опорного, прошедшего вне объекта. Результатом этого взаимодействия, зафиксированного обычным фотоспособом, является голограмма, которая несет полную информацию об объекте /и фазовую и амплитудную/. В данной работе голографический’ принцип был использован для создания оптической схемы двухлучевого интерферометра по типу Маха Цендера, в которой одно плечо интерферометра сформировано полем микрообъектива микроскопа, а второе его мнимым, голографическим изображением. 0сновной трудностью, с которой приходится сталкиваться при анализе биологических микрообъектов голографическими методами являются их малые размеры и слабое взаимодействие с излучением лазера /малый фазовый сдвиг/. Это приводит к тому, что уровень когерентных оптических шумов, возникающих в схеме, становится сравнимым с полезной информацией. Для устранения этого недостатка в схеме специально предусмотрено устройство для усреднения когерентных оптических шумов, которое позволяет получать высококачественные интерферограммы клеток размером до 5 мкм и их микрофотографии в лазерном свете /проходящем и отраженном/ с увеличением 2250 раз.

Рис. 1. А – Интерференционные картины. Слева направо: полосы в отсутствие объекта, интерферограммы сфероцита и дискоцита, их сечения, рассчитанные по интерференционным картинам. Б – принципиальная схема расчёта сечения эритроцита по его интерферограмме /пояснение в тексте/

Интерференционные картины, наблюдаемые в окуляре микроскопа, представляют собой в отсутствие объекта чередующиеся прямые, темные и светлые полосы, которые искажаются при внесении в поле микрообъектива клеток в зависимости от их оптических свойств (Рис. 1А). Задачей анализа интерферограмм эритроцитов являлось получение количественных характеристик о размерах, форме эритроцитов, массе и концентрации гемоглобина исходя из количественной оценки оптических свойств клеток.

Отклонение интерференционной полосы ∆У (x, y) (Рис. 1,Б) возникающее при внесении в поле объектива эритроцита, определяется уравнением:

∆У (Х,У) = S /λ ∆n(x,y) T (x, y) (1)

Где: S – расстояние между интерференционными полосами вне объекта; λ – длина волны излучения лазера (λ =0,6328 мкм для гелий-неонового лазера, используемого в данной работе); ∆n(x,y) разность показателей преломления внутри и вне клетки /измеряется при помощи рефрактометра/; T (x, y) – толщина эритроцита в точке измерения отклонения интерференционной полосы.

В уравнении /1/ величина ∆n(x, y) принимается за постоянную, так как показатель преломления внутри клетки постоянен. Это объясняется тем, что эритроцит по всему объему равномерно заполнен гемоглобином. Таким образом, в уравнении /1/ величина ∆У (x, y) измеряемая по интерферограмме клетки, связана прямой зависимостью с толщиной клетки T (x, y). Рассчитав значение толщины эритроцита вдоль его диаметра, можно построить поперечное сечение клетки /Рис. 1, Б/. Исходя из осевой симметрии эритроцитов, зная его сечение, рассчитывается площадь поверхности и объем эритроцитов. Более простой способ измерения состоит в расчёте этих параметров по микрофототрафиям эритроцитов, помещенных в аутоплазму, где клетки собраны в упорядоченные группы типа "монетных столбиков" .

Построение поперечного сечения эритроцитов позволяет проводить количественную оценку формы клетки. Для этого, при описании сечения эритроцита нами были введены коэффициенты: основные a(DC), b (BD), c (ED), d (AE) численные значения которых определялись по данным интерферометрии (Рис. 2) и производные: Кϕ = (b – d)/ c – коэффициент, описывающий степень прогиба центральной части клетки. Кэл.= b/a ,описывает периферическую часть’ клетки и с/R ( R радиус) показывает относительное расстояние от центра эритроцита до точки, где толщина клетки максимальна. Эти коэффициенты были использованы в дальнейшем для оценки изменений формы эритроцитов в норме и патологии (Рис. 5).

Рис. 2. Иллюстрация к определению основных ‘параметров формы эритроцитов (пояснение в тексте)

Величины для концентрации гемоглобина и его ‘массы в эритроцитах были получены для эритроцитов, переведенных в сферическую форму. Величина ∆n связана с объемной концентрацией внутриклеточных веществ (гемоглобина)– Cv ( Feleppa ‚ 1972) . Отсюда для концентрации гемоглобина имеем: Cv = ∆n/α, где α – характеристический коэффициент, определяемый оптическими свойствами вещества.

Масса гемоглобина m, определяется как произведение концентрации гемоглобина на, объем эритроцита. Для клеток сферической формы получаются простые выражения для Сv и m

Cv = 1,344 (∆Y max/S R) (2)

m = 5,63 ∆Ymax./S (3)

Где ∆Y max – максимальное отклонение интерференционной полосы, проходящей через центр эритроцита, S – расстояние между полосами вне клетки, R – радиус эритроцита.