Голографическая интерферометрия и лазерная микроскопия эритроцитов - Александр Николаевич Метелкин Страница 3

class="p1">Наблюдение эритроцитов в проходящем и отраженном пользованием лазерного освещения, с использованием микрокиносъемки и видеозаписи , позволило получить новые данные о процессах, преобразования формы эритроцитов от диска к сфере. Интерферограммы эритроцитов, полученные при их исследовании в отраженном свете, позволили наблюдать активное движение внутри эритроцитов в переходной стадии преобразования формы клетки (Рис. 6).

Проделанные в работе расчёты разрешающей способности лазерной микроскопии, оценка чувствительности голографической интерферометрии, определение погрешностей измерений, параметров формы и массы эритроцитов, показали, что предложенные методики оценки со стояния живых, нефиксированных эритроцитов расширяют возможности традиционных методов цитологического анализа и могут быть успешно использованы для количественных и качественных исследований эритроцитов и других типов клеток.

2. Сравнительная характеристика свойств эритроцитов по данным голографической интерферометрии и’ лазерной микроскопии в норме и патологии

В этой серии исследований эритроциты в аутоплазме сохраняли нормальную форму до конца эксперимента. Нами наблюдалось наличие неоднородности в распределении эритроцитов в зависимости от диаметра. Во всех обследованных группах детей /здоровых, больных диффузным гломерулонефритом, сахарным диабетом, наследственным сфероцитозом /НС/ наблюдалось полимодальное распределение эритроцитов.

Средние значения отдельных мод не зависели от вида патологии. Было выделено 5 средних модовых значений диаметров эритроцитов: 6,75 мкм, 7,45 мкм, 8,20 мкм, 8,80 мкм, 9,40 мкм. Процентное распределение эритроцитов по этим группам показало, что в норме 51,5% клеток относятся к группе со средним диаметром 8,20 мкм. При сахарном диабете зв этой группе находится 16,0% клеток, и 63,04 со средним диаметром 8,80 мкм. При гломерулонефрите менее выражено наличие центрального пика (38,5% со средним диаметром 8,20 мкм, 32,5% 8,80 мкм). При наследственном микросфероцитозе 35,0% эритроцитов имеют средний диаметр 8,20 мкм, и значительное число клеток малого диаметра (37,5# 7,45 мкм, 27,24 6,75 мкм). В отдельных случаях вместо полимодального распределения эритроцитов наблюдались две достоверно различающиеся группы (Р <0,05).

Сравнение эритроцитов по размерам: диаметр, толщина, площадь поверхности, объем, коэффициент сферичности, по параметрам формы Кϕ, К эл. С/R , по массе и концентрации гемоглобина в клетках не выявило значительных различий между группами здоровых детей и детей больных диффузным гломерулонефритом и сахарным диабетом. Популяции эритроцитов периферической крови здоровых детей и детей больных НС достоверно различались по всем параметрам (Р‹0,05) . (Таблица 1.) кроме объема, коэффициента С/R, массы (30,9 ± 1.1 пг, 29,1± 0,8 пг) и концентрации гемоглобина в клетках (36,6± 1,45%, 38,2± 1,46%).

Эритроциты, помещенные в аутоплазму, как в норме, так и при НС наблюдались в виде дисков, собранных в "монетные столбики". Истинные сфероциты при НС полностью отсутствовали, хотя они присутствовали в сухом мазке, как клетки уменьшенного диаметра. Средняя величина объема эритроцитов при НС практически совпадает со средней величиной объема эритроцитов в норме, а площадь поверхности снижена. Уменьшение площади поверхности эритроцитов при неизменном объеме приводит к разбуханию клеток при НС, что характеризуется сниженной величиной коэффициента сферичности: отношение площади поверхности к объему равно 1,22, в норме 1,65. Снижение коэффициента сферичности за счет уменьшения площади поверхности приводит к снижению осмотической резистентности эритроцитов при НС.

Рис. 3. Иллюстрация связи осмотической резистентности эритроцитов с коэффициентом сферичности. Пояснение в тексте.

Кривые осмотического гемолиза: Nг – число погибших эритроцитов в %, С NaCl концентрация хлористого натрия.

Распределение эритроцитов Nэ в % в зависимости от их коэффициента сферичности (S/V). Сплошная линия – норма, точечная – НС. Сдвиг кривой распределения эритроцитов в сторону меньших значений отношения S/V соответствует сдвигу кривой осмотической резистентности эритроцитов в сторону больших концентраций NaCl, что указывает на снижение осмотической резистентности при НС.

Кроме измерения средних величин методы голографической интерферометрии и лазерной микроскопии позволяют исследовать отдельные эритроциты одновременно по нескольким параметрам. Это позволяет выявлять характер соотношений между различными количественными характеристиками эритроцитов внутри популяции. Исследования показали наличие общих свойств эритроцитов в норме и при наследственном микросфероцитозе. Так, зависимость площади поверхности эритроцитов от их диаметров имеет общий вид в обоих случаях (Рис. 4).

Рис. 4. Зависимость площади поверхности S от диаметра эритроцитов /D/ в норме /ᴏᴏᴏᴏ/ и при НС /ххххх/.

Анализ эритроцитов по коэффициентам, характеризующим форму показал, что форма эритроцитов закономерно изменяется: с уменьшением диаметра наблюдается увеличение прогиба центральной части клеток, характеризующейся коэффициентом Кϕ, изменяется форма периферической части, которая оценивается по коэффициенту Кэл. и происходит сдвиг к центру клетки точки, в которой толщина эритроцита максимальна, уменьшается отношение С/R. При уменьшении диаметров эритроцитов от 9,40 мкм до 6,75 мкм величина, Кϕ увеличивается от 0,14 до 0,35, величина Кэл. увеличивается от 0,6 до 1,7, а отношение С/R уменьшается от 0,72 до 0,55 (Рис.5,А,Б,В)

Масса и концентрация гемоглобина в эритроцитах также изменяется в зависимости от диаметров эритроцитов и имеет одну и ту же закономерность как для нормы, так и для НС: с уменьшением диаметров эритроцитов наблюдается уменьшение их массы и увеличение концентрации гемоглобина в клетках (Рис. 5, Г, Д).

Рис. 5. А,Б,В – Зависимость параметров формы (Кэл, Кϕ, С/R); Г, Д – массы (m) и концентрации гемоглобина (Cv) от диаметров (радиусов) эритроцитов (D, R ) в норме (++++++) и при наследственном сфероцитозе (........) Пояснения в тексте.

Теоретический анализ количественных экспериментальных данных показал, что изменения площади поверхности, объема, массы и концентрации гемоглобина, наблюдаемые при уменьшении диаметров эритроцитов по-видимому, могут быт., объяснены с помощью учета последствий отщепления от поверхности эритроцитов микропузырьков определенного размера. С помощью расчётов установлено, что для изменения площади поверхности, объема, массы гемоглобина и его концентрации в эритроците со средними параметрами в норме до состояния со средними параметрами при наследственном сфероцитозе потребуется порядка 20 отщеплений микропузырьков со средним радиусом Rj =0,34 мкм. При этом сохраняются все количественные соотношения параметров эритроцитов, полученные в эксперименте. Теоретический анализ показал, что в отщепляющихся микропузырьках может находиться гемоглобин в концентрациях, меньших, чем в исходной клетке, при этом после каждого отщепления объемная концентрация гемоглобина ( Cv в %) в эритроците возрастает.

Сравнение результатов анализа эритроцитов методами голографической интерферометрии и лазерной микроскопии с литературными данными показало, что величина среднего диаметра эритроцитов (8,20 мкм) соответствует данным, полученным при измерениях эритроцитов в плазме. Измеренные новым методом средние величины площади поверхности и объема эритроцитов несколько ниже данных, имеющихся в литературе. Это объясняется тем, что при измерениях площади поверхности и объема эритроцитов традиционными методами не учитываются особенности формы эритроцита, а их форма экстраполируется в общем случае к форме цилиндра (Тодоров И., 1961, Мосягина Е.Н., 1969). Данные