Голографическая интерферометрия и лазерная микроскопия эритроцитов - Александр Николаевич Метелкин Страница 4

Имеющиеся в литературе сведения о полимодальной структуре распределения эритроцитов человека по диаметру в норме (Вергунова 3.И., 1979), подтверждены в данной работе для эритроцитов в норме и патологии.

Количественная оценка изменений формы, площади поверхности эритроцитов, массы и концентрации гемоглобина в клетках дополняет имеющиеся в литературе сообщения об изменениях, происходящих с эритроцитами в процессе старения. Показано, что при старении эритроцитов наблюдается уменьшение его диаметра (Бриллиант М.Д. ‚1979), изменение формы клеток (Gonsoni е.a.,1976), возрастание концентрации гемоглобина (Seaman е.а., 1977).

Известные данные о решающей роли фрагментации поверхности эритроцита в процессах старения (Рябов б.И., 1971) дают основания для проведения теоретического анализа влияния процесса отщепления микропузырьков от поверхности эритроцитов на изменение его свойств. Результаты теоретических расчётов согласуются с экспериментальными данными, что может служить еще одним подтверждением в пользу представлений о роли фрагментации поверхности эритроцитов в процессе их жизнедеятельности. Результаты исследований, проведенных методами голографической интерферометрии и лазерной микроскопии, хорошо согласуются с современными представлениями об эритроците, что служит доказательством достоверности результатов. Данные о наличии общих свойств эритроцитов для нормы и патологии указывают на существование единого механизма, под действием которого происходит изменение эритроцитов при различных условиях их жизнедеятельности.

Результаты исследований, проведенных методами голографической интерферометрии и лазерной микроскопии, хорошо согласуются с современными представлениями об эритроците, что служит доказательством достоверности результатов. Данные о наличии общих свойств эритроцитов для нормы и патологии указывают на существование данного механизма, под действием которого происходит изменение эритроцитов при различных условиях их жизнедеятельности.

3. Голографическая интерферометрия и лазерная микроскопия эритроцитов in vitro

В этой серии экспериментов исследовались эритроциты в норме и эритроциты детей больных наследственным микросфероцитозом (НС). Для облегчения расчётов и единообразия получения результатов анализ эритроцитов, помещенных в аутоплазму, проводился при условиях, когда клетки находились в виде "монетных столбиков", при этом истинных микросфер при НС не наблюдалось.

Рис. 6. Кинограмма интерференционных картин эритроцитов в отраженном лазерном свете. Время между кадрами 1 сек. (Движение внутри эритроцитов наблюдается по смещению интерференционных полос).

При разведении аутоплазмы изотоническим раствором NaCl в соотношении 1:1 и 1:5 в условиях изотонии как в норме, так и при НС, наблюдался распад "монетных столбиков" на отдельные клетки нормальной формы (двояковогнутый диск). Дальнейшее разведение аутоплазмы 0,9% раствором NaCl (1:2 и 1:8) приводило к появлению эритроцитов с выступами по краям и отдельными неровностями на поверхности. При разведении аутоплазмы (1:1О и более) происходило увеличение неоднородности поверхности эритроцитов, изменение их формы до эллипсоидальной и далее осуществлялся переход эритроцитов в сферическую форму. С помощью микрокиносъемки в отраженном лазерном свете было показано наличие интенсивного внутриклеточного движения в эритроцитах, находящихся в переходном от диска к сфере состоянии. (Рис. 6). Анализ размеров исходной формы двояковогнутого диска и конечной (сферической) показал, что изменение формы клеток сопровождается уменьшением их диаметра и площади поверхности в норме и при НС (Р<0,01), а объем при этом достоверно не изменяется.

Уменьшение общей площади поверхности эритроцитов, отмечаемое по данным интерферометрии, объясняется, по-видимому, тем, что сферуляция сопровождается образованием микровыростов, малые размеры которых не могут быть количественно учтены данным методом. Нами наблюдалось два типа сфероцитов: шиповидные с выростами на поверхности и игольчатые, с исчерченной поверхностью, без выростов.

Первый тип отмечался в основном у эритроцитов крови здоровых детей, второй у эритроцитов больных НС. Было показано, что процесс перехода от диска к сфере обратим: при переносе эритроцитов сферической формы в аутоплазму они восстанавливают свою форму до двояковогнутого диска, что подтверждается данными сканирующей электронной микроскопии (Denhcke, 1968, Weed Besis, 1973).

Для проведения сравнительной характеристики эритроцитов в норме и при НС по признаку сферуляции было выбрано два основных разведения плазмы (1:5 и 1:1О), при которых проводился анализ распределения эритроцитов в зависимости от их формы (таблица 2).

Таблица 2. Процентное распределение эритроцитов в зависимости от их формы при двух разведениях плазмы изотоническим раствором (1:5 и 1:1О) в норме и при наследственном сфероцитозе ( НС)

Сравнение полученных данных показало, что эритроциты больных НС переходят от формы двояковогнутого диска к сфере при меньших разведениях аутоплазмы изотоническим раствором NaCl по сравнению с нормой.

Переход эритроцитов в сферическую форму наблюдался также при механическом воздействии на клетку, так же при добавлении гетерогенной сыворотки. Эритроциты, выделенные из селезенки сразу после ее удаления по поводу НС, также имели сферическую форму.

Второй тип изменений формы эритроцитов имел место при разведении взвеси эритроцитов изотоническим раствором глюкозы. При этом наблюдалось общее искажение формы эритроцита, образование утолщения по краям, нарушение симметрии формы эритроцитов.

Третья группа изменений формы эритроцитов имела место при анализе клеток, предварительно подвергшихся аутогемолизу ( t =37 градусов по С) , 5-6 часов).Эритроциты при разведении аутоплазмы изотоническим раствором NaCl исследовались в микроскопе с лазерным освещением. Клетки имели искаженную поверхность, на которой постепенно

выбухали микропузырьки. Они некоторое время сохраняли связь с эритроцитами в виде жгутиков, а затем полностью отделялись от клеток.

Полученные данные можно представить в виде схемы (Рис. 7), в которой показаны три пути изменения размеров и формы эритроцитов. Причем, если первый и третий пути являются в принципе обратимыми, то второй путь необратим, вследствие потери части поверхности клетки в виде микропузырьков.

Рис. 7. Основные типы изменений формы и размеров эритроцитов. (Пояснение в тексте.)

Исследованные типы изменений формы эритроцитов хорошо согласуются с классификацией, предложенной на основе анализа клеток по данным электронной микроскопии (Козинец Г.И., соавт., 1979) но по данным голографической интерферометрии и лазерной микроскопии размеры эритроцитов значительно отличаются от результатов, полученных методом растровой электронной микроскопии, так как при обработке эритроциты уменьшаются в размерах (Крымский Л.Д. ‚соавт., 1976).

Исследование новыми методами динамики перехода формы эритроцита от диска к сфере и явления отщепления микропузырьков от поверхности клеток представляет значительный интерес, так как по современным данным эти явления лежат в основе того многообразия форм и типов эритроцитов, наблюдаемых с помощью электронномикроскопических методов в норме и патологии. Показано, что сферуляция эритроцитов может происходить in vitro как при действии различных веществ ( La Selle e. а. ,1980), так и пря взаимодействии с макрофагами ( Guerry е.а. , 1967). Длительное хранение эритроцитов также в конечном итоге приводит к изменению формы эритроцитов до сферической (Крымский Л.Д., соавт., 1976). Сфероциты отмечаются при различного рода анемиях